第四章　血液分析仪及其临床应用

第一节　概　述

　　20世纪50年代初，电子血细胞计数仪开始应用于临床，随着电子技术、流式细胞术、激光技术、单克隆抗体、计算机等高科技在血细胞分析仪上的应用，血液分析仪的研制水平不断提高，检测原理不断完善，测量参数不断增多，现代血液分析仪（HA）具有下列特点：
　　1.自动化程度越来越高。
　　2.通过条形码识别、自动运输装置、自动混匀、自动进样、自动检测、自动报告、自动清洗、自动涂片，形成了模块式自动化血液分析流水线。
　　3.提供参数越来越多： 能提供18～40多个参数，如有核红细胞数、淋巴细胞亚群数等。
　　4.精度越来越高： 采用定容计量、定时监控、三次平均法计数、延时计数等使精密度大大提高。
　　5.速度越来越快：每小时可分析50～150份样本。
　　6.强大的质控功能：有自动记录质控结果、可供选择的质控规则、自动绘制质控图、失控报警、患者结果浮动均值和患者结果Delta核查和报警等功能。
　　7.智能化程度越来越高：提供简明直观的直方图或散点图、提示异常结果报警信号、备有专家诊断系统和远程会诊等功能。

第二节　检测原理

　　本节要点：
　　（1）电阻抗法血液分析仪检测原理
　　（2）光散射法血液分析仪检测原理
　　（一）电阻抗法血液分析仪检测原理
　　1.电阻抗法血细胞计数原理（库尔特原理）
　　将等渗电解质溶液稀释的细胞悬液置入不导电的容器中，将小孔管（也称传感器）插进细胞悬液中。小孔管内充满电解质溶液，并有一个内电极，小孔管的外侧细胞悬液中有一个外电极。当接通电源后，位于小孔管两侧电极产生稳定电流，稀释细胞悬液从小孔管外侧通过小孔管壁上宝石小孔（直径<l00μm，厚度约75μm）向小孔管内部流动，使小孔感应区内电阻增高，引起瞬间电压变化形成脉冲信号，脉冲振幅越高，细胞体积越大，脉冲数量越多，细胞数量越多，由此得出血液中血细胞数量和体积值。

电阻抗原理示意图

　　2.白细胞分类计数原理
　　根据电阻抗法原理，经溶血剂处理的、脱水的、不同体积的白细胞通过小孔时，脉冲大小不同，将体积为35～450fl白细胞，分为256个通道，其中，淋巴细胞为单个核细胞、颗粒少、细胞小，位于35～90fl的小细胞区，粒细胞（中性粒细胞）的核分多叶、颗粒多、胞体大，位于160fl以上的大细胞区，单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、原始细胞、幼稚细胞等，位于90～160fl的单个核细胞区，又称为中间型细胞。仪器根据各亚群占总体的比例，计算出各亚群细胞的百分率，并同时计算各亚群细胞的绝对值，显示白细胞体积分布直方图。

三分类血球分析仪工作原理示意图

　　3.血红蛋白测定原理
　　当稀释血液中加入溶血剂后，红细胞溶解并释放出血红蛋白，血红蛋白与溶血剂中的某些成分结合形成一种血红蛋白衍生物，在特定波长（530～550nm）下比色，吸光度变化与稀释液中Hb含量成正比，最终显示Hb浓度。不同类型血液分析仪，溶血剂配方不同，所形成血红蛋白衍生物不同，吸收光谱不同，如含氰化钾的溶血剂，与血红蛋白作用后形成氰化血红蛋白，其最大吸收峰接近540nm。
　　（二）光散射法血液分析仪检测原理
　　1.光散射法白细胞计数和分类计数原理
　　（1）激光与细胞化学法
　　1）过氧化物酶检测通道
　　白细胞经过氧化物酶染色后，胞质内显示细胞化学反应。过氧化物酶活性：嗜酸性粒细胞>中性粒细胞>单核细胞，淋巴细胞和嗜碱性粒细胞无过氧化物酶活性，此为血液分析仪白细胞分类的基础。当激光束照射到细胞时，产生不同强度的散射光，以吸光率（酶反应强度）为X轴，光散射（细胞大小）为Y轴，每个细胞根据这两个信号的不同，定位在散点图上。

各类白细胞在散点图上的位置

　　2）嗜碱性粒细胞／分叶核检测通道
　　血液与酸性表面活性剂反应，不仅红细胞溶解，而且除嗜碱性粒细胞外，其他所有白细胞膜均被破坏.胞质溢出，仅剩裸核。当激光束照射到细胞时，产生不同强度的散射光，形成二维细胞图，其中，嗜碱性粒细胞呈高狭角散射，定位于细胞图上部，裸核细胞则位于细胞图下部。

嗜碱性粒细胞和分叶核粒细胞在散点图上位置

　　（2）容量、电导、光散射（VCS）法
　　1）利用电阻抗法原理测量细胞体积（V）。
　　2）利用电导（C）技术测量细胞内部结构。原理是利用高频电磁探针测量细胞内部结构，根据细胞核和细胞质比例、细胞内颗粒大小和密度来识别体积相同、但性质不同的两类细胞群体，如小淋巴细胞和嗜碱性粒细胞。
　　3）利用光散射（S）技术测量细胞形态和核结构。原理是利用激光照射进入计数区的每个细胞，根据散射光角度（10°～70°）的不同，提供每个细胞形态、核结构信息来鉴别中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。

五分类血球分析仪原理示意图

　　V（volume）体积测量采用电阻抗原理；C（conductivity）电导性是根据细胞壁能产生高频电流的性能，采用高频电磁探针测量细胞内部结构；S（scatter）光散射是来自激光的单色光束对细胞进行扫描，提供细胞结构和形态的变化。
　　根据VCS原理，显示3种细胞散点图：DF1（体积和散射光）、DF2（体积和电导）、DF3（体积和电导，但只显示嗜碱性粒细胞群）。

DF1图通过体积和散射光显示不同白细胞位置

　　
DF2图通过体积和电导显示单核细胞、粒细胞和淋巴细胞位置

DF3通过体积和电导显示嗜碱性粒细胞群、单核细胞和淋巴细胞位置

　　（3）电阻抗与射频法
　　1）嗜酸性粒细胞检测系统：血液与嗜酸性粒细胞特异性溶血剂混合，使除嗜酸性粒细胞外的所有细胞溶解或萎缩，采用电阻抗法计数嗜酸性粒细胞。
　　2）嗜碱性粒细胞检测系统:血液与嗜碱性粒细胞特异性溶血剂混合，使除嗜碱性粒细胞外的所有细胞溶解或萎缩，采用电阻抗法计数嗜碱性粒细胞。
　　3）白细胞分类检测系统：采用电阻抗和射频（能透入细胞内，测量核大小、颗粒多少）法，以直流电（DC）为横坐标，以射频（RF）为纵坐标，根据这两个信号将细胞定位于二维细胞散射图上，因淋巴细胞、单核细胞、粒细胞的大小、胞质量、胞质内颗粒大小和密度、细胞核形态和密度各不相同，从而进行分类。
　　4）幼稚细胞检测系统：根据幼稚细胞膜上脂质较成熟细胞少的特性进行检测。在细胞悬液中加入硫化氨基酸，幼稚细胞的结合量多于较成熟的细胞，而且，幼稚细胞对溶血剂有抵抗作用，当加入溶血剂后，成熟细胞被溶解，幼稚细胞不被破坏，从而提供幼稚细胞信息（IMI）。

显示幼稚细胞的位置

　　（4）多角度偏振光散射（MAPSS）法
　　当激光束照射到单个细胞时，从4个角度测定散射光密度：①0°：前角光散射（1°～3°），可测定细胞大小；②10°：狭角光散射（7°～11°），可测定细胞内部结构特征；③90°：垂直光散射（70°～110°），可测定细胞核分叶情况；④-90°：消偏振光散射（70°～110°），可将嗜酸性粒细胞和其他细胞区分出来。

多角度偏振光散射（MAPSS）法检测原理

　　2.光散射法红细胞检测原理
　　以低角度前向光散射和高角度光散射同时测量1个红细胞。低角度（2°～3°）光散射能测量单个红细胞体积，高角度（5°～15°）光散射能测量单个红细胞血红蛋白浓度，得出MCV、MCH、MCHC值，并显示红细胞散射图、单个红细胞体积和血红蛋白含量直方图。
　　3.光散射法血小板检测原理
　　单个球形化血小板通过激光束照射后，高角度（5°～15°）光散射能测量细胞折射指数（RI），低角度（2°～3°）光散射能测量细胞大小。在二维散射图上得出血小板数量和相关参数。
　　4.网织红细胞计数原理
　　（1）利用新亚甲蓝使网织红细胞RNA着色，加入使红细胞内Hb溢出的试剂，使其成为“影细胞”，然后采用VCS原理，得出网织红细胞数和相关参数。
　　（2）利用碱性槐黄O等荧光染料与网织红细胞内的RNA结合，以波长488nm氩氖激光束为激光源照射网织红细胞，得到前向散射光强度（细胞体积大小）和荧光强度（胞质内RNA多少），形成二维显示散点图，得出网织红细胞数和相关参数。

显示网织红细胞（不同荧光强度）（左）显示红细胞、网织红细胞和血小板（右）

　　第三节　检测参数

　　本节要点：
　　（1）检测参数
　　（2）检测结果及表达形式
　　（一）检测参数
　　常见血液分析仪检测报告的术语和英文缩写词见表l-4-2。
　　表1-4-2 常见血液分析仪检测报告技术语和英文缩写词

　　
　　（二）检测结果及表达形式
　　常用三分群血液分析仪参考值见表1-4-3。
　　
　　

第四节　血细胞直方图

　　本节考点：
　　（1）白细胞直方图
　　（2）红细胞直方图
　　（3）血小板直方图

左图是细胞形成的不同大小的脉冲波，右图是根据脉冲波整理出的细胞直方图

　　（一）白细胞直方图
　　血液分析仪在计数细胞数量的同时，还提供细胞体积分布图形，横坐标为细胞体积大小，纵坐标为不同体积细胞的相对频率，称为细胞直方图。

　　白细胞直方图代表意义
　　正常白细胞直方图，在35～450fl范围内将白细胞分为3群，左侧峰又高又陡为淋巴细胞峰，最右侧峰又低又宽为中性粒细胞峰，左右两峰间的谷区较平坦为单个核细胞峰。异常直方图意义见表1-4-4。
　　表15 白细胞体积三分类

　　
　　

　　急性淋巴细胞白血病时的白细胞直方图特点
　　
　　急性淋巴细胞白血病时的白细胞直方图特点
　　
　　急性非淋巴细胞白血病时的白细胞直方图特点
　　
　　慢性淋巴细胞白血病时的白细胞直方图特点

　　所以，当发现某患者白细胞直方图改变为一个单一峰的曲线，务必要对血涂片进行检查，以排除急性白血病。千万不要漏诊。
　　

　　单核细胞增多或嗜酸细胞增多症时的白细胞直方图特点
　　
　　异常淋巴细胞增多症时的白细胞直方图特点
　　　　
　　慢性粒细胞白血病时的白细胞直方图特点

　　（二）红细胞直方图

　　红细胞直方图曲线的峰顶对应的是红细胞的MCV，而曲线基底的宽度基本上反映红细胞的RDW。
　　正常红细胞直方图，在36～360fl范围内分布两个细胞群体，从50～125fl区域有一个两侧对称、较狭窄的曲线，为正常大小的红细胞，从125～200fl区域有另一个低而宽的曲线，为大红细胞、网织红细胞。，当红细胞体积大小发生变化时，峰左移或右移，或出现双峰。
　　（三）血小板直方图
　　正常血小板直方图，在2～30fl范围内分布，呈左偏态分布，集中分布于2～15fl内。当有大血小板或小红细胞、聚集血小板时，直方图显示异常。

　　血小板直方图
　　

　　受干扰的异常血小板直方图（a）大量红细胞碎片，（b）多数血小板聚集，（c）小红细胞增多。

第五节　方法学评价

　　本节考点：
　　（1）仪器性能的评价
　　（2）干扰血液分析仪检测的因素
　　（一）仪器性能评价

　　1989年，ICSH公布了用于评价血液分析仪性能、优点和局限性的《含白细胞分类、网织红细胞计数和细胞标志检测的血液分析仪评价指南》。仪器性能评价内容见表1-4-5。
　　
　　1.样本要求
　　血液样本要求在采集后4小时内进行处理，并需要各种类型的样本，以反映血液中各种成分质和量的变化（表1-4-6）。
　　
　　2.性能评价
　　（1）稀释效应：包括①受倍比稀释影响的参数：用同源乏血小板血浆稀释压积细胞，得到各种浓度，如l00%，90%，80%……20%，10%，评价稀释度与参数之间的线性关系。理想情况下，线性范围越宽越好、回归线应通过原点。②不受稀释效应影响的参数：如红细胞平均指数，不受稀释度影响，理论上应为一条水平回归线。
　　（2）精密度：包括批内、批间精密度和总精密度。①批内和批间精密度：是对同一批样本（批内或重复精密度）或二至多批样本（批间精密度）的重复测定，用CV值表示。理论上，精密度研究样本应覆盖整个病理范围，包括高、中、低值，进行重复测定，采用双因素方差分析进行批内、批间精密度评价。批间精密度受仪器校准和仪器漂移的影响。②总精密度：总重复性由批内、批间精密度和携带污染结果得出。实验时从一个较大范围中随机抽取样本，并在几小时内测定，采用单因素方差分析进行评价。若总精密度评价在较长时间内完成，样本贮存和稳定性也是重要影响因素。
　　（3）携带污染：在运行临床样本前，必须对高值和低值样本的携带污染进行评价，保证交叉测量时仪器结果的稳定性。方法是连续测试高值样本3次（il、i2、i3），随后立即连续测试低值样本3次（jl、j2、j3），按下列公式计算：
　　
　　（4）相关性：是仪器测定结果与常规方法相比的满意程度。采用大量的、未经选择的、覆盖所有预期范围的样本，用图形表达方式显示被评估仪器（Y轴）和常规方法（X轴）测定结果的差异，采用配对t检验进行统计分析。
　　（5）准确度：是“估计值与真值之间的一致性”。真值由决定性方法或参考方法获得。血细胞计数的参考方法见表l-4-7。
　　
　　（6）样本老化：是采集静脉血样本，观察随时间增加测定结果的变化量。采集l0份样本，5份为正常，5份为异常，样本分别贮存在室温和4℃，并在0小时、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、48小时和72小时内测试。以百分比或绝对值-时间作图，观察被测参数的变化。
　　（7）样本异常干扰物和敏感性：在相关性研究中，应测试大量的非选择性样本，若有必要，可对异常样本或已知干扰物样本进行特殊研究（表1-4-8）。
　　
　　　　（二）干扰血液分析仪检测的因素
　　见表l－4－9。
　　
　　
　　

　　受干扰的白细胞直方图a.聚集的血小板干扰 b.不完全溶解的红细胞干扰
　　
　　不同干扰情况下的血小板直方图a.大血小板直方图（曲线后半部分增宽和延伸）
　　
　　b.小血小板直方图（曲线后半部分缩窄）
　　
　　聚集的血小板直方图（曲线后半部分上扬并延伸、血小板计数假性减低）
　　
　　聚集的血小板直方图（曲线平坦并延伸、血小板计数假性减低）
　　
　　小红细胞干扰的血小板直方图（曲线尾部抬高、延伸、血小板计数假性增高）

第六节　临床应用

　　本节考点：
　　（1）部分检测参数的临床意义
　　（2）红细胞直方图在贫血中的应用
　　（一）部分检测参数临床意义（相关专业知识,专业实践能力）
　　1.红细胞血红蛋白分布宽度（HDW）　
　　反映红细胞内Hb含量异质性的参数，用单个红细胞Hb含量的标准差表示，正常参考范围为24～34g／L。遗传性球形红细胞增多症时RDW、HDW明显增高，为小细胞不均一性高色素性贫血。
　　2.血小板平均体积（MPV）
　　（1）鉴别血小板减低的病因：MPV增高，见于外周血血小板破坏过多所致血小板减低。MPV减低，见于骨髓病变所致血小板减低。
　　（2）评估骨髓造血功能恢复情况：局部炎症时，骨髓造血未抑制，MPV正常。败血症时，骨髓造血受抑制，MPV减低。白血病缓解时，MPV增高。骨髓造血衰竭，MPV和血小板计数持续减低。骨髓功能恢复时，MPV先上升，血小板计数随后上升。
　　（3）与血小板计数之间的关系见表1-4-10。
　　
　　3.血小板分布宽度（PDW） （相关专业知识）
　　仪器测量一定数量血小板体积后，计算所得外周血血小板体积大小异质性参数。用血小板体积变异系数来表示（CV）。PDW增大见于急性白血病化疗后、巨幼细胞性贫血、慢性粒细胞白血病、脾切除后、巨大血小板综合a征、血栓性疾病、原发性血小板增多症、再生障碍性贫血。PDW减低见于反应性血小板增多症。
　　表 18 血小板参数在不同血液病中鉴别意义

　　　　4.低荧光率网织红细胞（LFR）和高荧光率网织红细胞（HFR）（专业知识）
　　（1）骨髓移植：网织红细胞计数是监测骨髓造血恢复的重要参数，通常移植成功后网织红细胞比白细胞提前3～4d增高。HFR增高提示有较多未成熟细胞从骨髓进入外周血，故HFR变化比网织红细胞计数变化具有更重要意义。
　　（2）贫血：溶血性贫血时Ret、LFR、HFR明显增高。肾性贫血时HFR上升、LFR下降、Ret正常。
　　（3）放疗和化疗：长期化疗导致网织红细胞亚群发生变化，HFR、MFR（平均荧光率网织红胞）减低早于LFR。骨髓恢复时，HFR、MFR又迅速上升。
　　5.网织红细胞成熟指数（RMI）
　　RMI=（MFR+HFR）／LFR×100，参考值见表l-4-ll。RMI增高，见于溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜（ITP）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、急性白血病、真性红细胞增多症、再生障碍性贫血、多发性骨髓瘤。RMI减低，提示骨髓衰竭和造血无效，见于巨幼细胞性贫血。

l-4-ll 网络红细胞成熟指数参考值

　　6.未成熟网织红细胞指数（IRF）
　　指未成熟网织红细胞与总网织红细胞百分比。未成熟网织红细胞体积较大，含RNA的量多。
　　（1）IRF与网织红细胞计数关系：见表l-4-12。
　　
　　（2）监测骨髓移植后恢复情况：骨髓移植后，全血细胞计数、白细胞分类计数、网织红细胞计数是监测骨髓恢复造血的早期指标。IRF较中性粒细胞绝对值、网织红细胞计数更早反映骨髓细胞生成和骨髓移植成功。IRF比骨髓移植前增高>20%时，表示红系移植成功。IRF是骨髓移植成功最早、最灵敏的指标。
　　（3）监测肾移植后红细胞生成情况：肾移植后，IRF增高比网织红细胞计数早7d，是肾移植成功较早、较灵敏的指标。
　　7.单个网织红细胞血红蛋白量（CHr）
　　可用于鉴别缺铁性贫血（减少）和非缺铁性贫血，是缺铁性贫血治疗有效的早期指标，在珠蛋白生成障碍性贫血患者CHr也可减少。
　　（二）红细胞直方图在贫血中的应用（相关专业知识，专业实践能力）
　　1.小细胞性贫血
　　（1）RDW正常：红细胞主峰左移，分布在55～100fl，波峰在75fl处，基底较窄，为小细胞低色素均一性图形，见于轻型地中海贫血。

轻型珠蛋白生成障碍性贫血红细胞直方图

　　（2）RDW轻度增高：红细胞主峰左移，分布在55～100fl，波峰在65fl处，为小细胞低色素和细胞不均一性图形，见于缺铁性贫血。

　　缺铁性贫血红细胞直方图

　　（3）RDW明显增高：红细胞显示双峰，小细胞峰明显左移，波峰在50fl处，大细胞峰顶在90fl处，基底较宽，为小细胞低色素不均一性图形，见于铁粒幼细胞性贫血、缺铁性贫血经治疗有效时。

铁幼粒细胞性贫血红细胞直方图

　　2.大细胞性贫血

巨幼细胞性贫血红细胞直方图

　　（1）RDW正常：红细胞主峰右移，分布在75～130fl，波峰在100fl处，为大细胞性图形，见于溶血性贫血、白血病前期、再生障碍性贫血、巨幼细胞性贫血。
　　（2）RDW轻度增高：红细胞峰右移，基底增宽，分布在75～150fl，波峰在105fl处，为大细胞不均一性图形，见巨幼细胞性贫血。
　　（3）RDW明显增高：红细胞峰右移，出现双峰，以l00fl处峰为主，为大细胞不均一性图形，见于巨幼细胞性贫血治疗初期。
　　3.正细胞性贫血
　　（1）RDW正常：红细胞分布在55～l10fl，波峰在88fl处，为正常红细胞图形，见于慢性病贫血、急性失血、骨髓纤维化、骨髓发育不良。
　　（2）RDW轻度增高：红细胞分布在44～120fl，波峰在80fl处，为红细胞不均一性图形，见于血红蛋白异常、骨髓纤维化。
　　（3）RDW明显增高：红细胞分布在40～150fl，波峰在90fl处，为红细胞不均一性图形，见于早期或混合性营养不良。