“无处不在的微生物”实验感想

韩俊 1453110

在此次实验课上，通过老师生动细致的理论讲解以及自己的动手实验，我收获颇多，主要有以下几点：

1.微生物主要分为细菌，真菌，病毒三类，个体微小，构造简单，多为单细胞，简单多细胞，以及非细胞结构。

2.细菌的形态主要有杆菌，球菌，螺旋菌三类，在致病细菌中，以结核杆菌，金黄色葡萄球菌，破伤风杆菌较为常见。结核杆菌可生长在身体各部，但由于其是好氧型细菌，在肺内繁殖的机会更大；金黄色葡萄球菌分布广泛，可引起化脓感染，如扁桃体炎；破伤风杆菌为厌氧型细菌，当人体受伤部位较深时，可在伤口内繁殖。旧时由于医疗条件差，新生儿出生时仅用火烧过的剪刀剪脐带，而破伤风杆菌生命顽强，所以有新生儿因此感染破伤风而死亡；

3.微生物分布极为广泛，数量也相当庞大，但其中大部分对人体无利也无害。对人体有害的细菌主要是上述致病菌以及对生活造成影响的细菌如霉菌等，对人类有利的细菌有酵母菌，乳酸菌等，被广泛用于食品加工及相关行业。而如大肠杆菌，在人体大肠中有分布，还可用于胰岛素的载体，但若在错了地方，它也可变成一种致病菌。

4.实验一：观察大肠杆菌形态

取样——烘干——固定——染色——干燥

观察到淡紫色颗粒状细菌

5.实验二：观察牙垢中的螺旋菌

取样——铺片——干燥——观察

（结果并未观察到……）

通过这次实验课，我了解了微生物的形态，分布，及基本的观察方法，看到了显微镜下的奇妙的微生物们，同时，通过操纵显微镜，提高了自己的动手能力，收获很大。

 

第二篇：微生物育种实验

微生物育种实验内容

[实验一] 用氯化钙制备感受态大肠杆菌

[实验二] 感受态大肠杆菌的转化

[实验三] 用硅胶膜分离法小量提取质粒

[实验四] 质粒的酶切与电泳鉴定

[实验五] 酿酒酵母原生质体制备与观察

[实验六] 酵母染色体DNA的提取

[实验一] 用氯化钙制备感受态大肠杆菌

一 实验目的

（1）掌握用氯化钙制备感受态细胞的原理。

（2）了解并熟练制备感受态细胞的基本方法。

二 实验原理

所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。

将快速生长中的大肠杆菌（对数生长期）置于经低温预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球），细胞膜通透性发生变化，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，使细菌处于容易吸收外源DNA的状态。

三 实验材料

LB培养基 ：NaCl 10 g/L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/L

氯化钙溶液 0.1mol/L: 取无水氯化钙11.1 g溶液1 L水中(4 ℃保藏)

以上试剂均0.08 mPa，灭菌20 min

37℃回转式恒温调速摇瓶柜

恒温水浴锅（两台，分别为37℃、42℃）

台式高速离心机

四 实验步骤

(1)挑取大肠杆菌JM109新鲜单菌落一个于装有15 ml液体LB培养基的100 mL三角瓶中，37℃振荡培养至OD值为0.3～0.4，将装有菌液的三角瓶放入冰水中，轻轻摇晃使菌液迅速冷却。

(2)取预冷的1.5 mL离心管若干个，用无菌枪头将菌液分装到离心管中，每管装菌液1.5 mL。

(3)离心管迅速放入冰水中，静止30分钟。

(4)8,000r/m 离心30 s，离心后将离心管迅速放入冰水中静置2 min，弃尽上清液。加入预冷的氯化钙溶液约400 mL，轻轻吹吸悬浮菌体，于冰水中放置20 min。

(5)重复实验步骤(4)两次。

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(6)8,000 r/m离心30 s，迅速放回冰水中，静置2 min。弃尽上清，加入预冷的氯化钙溶液100 mL，轻轻吹吸悬浮菌体，菌悬液迅速放回冰水中。

所获菌悬液即为感受态细胞，可立即用于转化，也可在4 ℃放置12～24 h这样可获得更高的转化率。采用这一方法要获得较高的转化率的关键是保持低温，即菌液离开冰水的时间要尽量短。

五 结果与讨论

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[实验二] 感受态大肠杆菌的转化

一 实验目的

（1）掌握基因工程中质粒转化的原理；

（2）学会操作转化实验的方法和技巧。

二 实验原理

转化（transformation）是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。

本实验是以重组质粒pUC19作为外源DNA，因pUC19携带氨苄青霉素抗性基因，当用pUC19转化时，转化子具有新的氨苄青霉素抗性基因遗传性状，在含有一定浓度的氨苄青霉素平板上，受体细胞不能生长，而只有转化子才能生长繁殖。

三 实验材料

重组质粒pUC19，本实验室构建。

四 实验步骤

①取感受态细胞一管，在冰水中放置10 min

②加入待转化的质粒0.5 μL，轻轻混匀，在冰水中放置30 min。

③将管子放入42 ℃水浴中，准确计时90 s，迅速取出放回冰水中，静止5 min。

④加入液体LB培养基800 μL，轻轻混合，37 ℃水浴45 min。

⑤将菌液适当稀释后涂布含相应抗菌素(Amp)的固体LB平板，37℃培养培养12～18h后即可见菌落。

菌落分离后用于实验三，质粒提取。

五 结果与讨论

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[实验三] 用硅胶膜分离法小量提取质粒

一 实验目的

掌握用硅胶膜分离法小量提取质粒的原理及操作方法。

二 实验原理

在含强阴离子洗涤剂的碱性溶液中细胞破裂而染色体和蛋白质变性，并和破裂的细胞壁互相缠绕成大型复合物，分子量较小的质粒DNA和RNA释放到上清液中，前者被被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效的沉淀下来。

用SDS和强碱处理细胞是使质粒和染色体分离的关键步骤，硅胶具有一特殊的性质，即在高离子强度的溶液中可以与核酸专一性的结合，而在离子强度降低后又能与所结合的核酸分离。质粒提取试剂盒就是根据这一原理实现质粒的快速纯化。

三 实验材料

3.1质粒提取试剂

质粒提取试剂盒

溶液I、溶液II、溶液III、结合缓冲液、漂洗液、洗脱缓冲液

3.2提取质粒电泳实验材料及仪器

50×TAE缓冲液：Tris 242 g，冰醋酸 57.1 mL，0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 100 mL，定容至1 L； TAE缓冲液：取50×TAE缓冲液10mL，加入纯水至500 mL；

溴化乙锭溶液：10 mg，加水至1 mL，充分溶解；

电泳槽：迷你-31B型，北京六一仪器厂（含电泳槽，制胶槽）；

电泳仪：DYY-6B 稳压稳流电泳仪。

四 实验步骤

①接种重组大肠杆菌一环于含氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜。

②取1.5 ml离心管，倒入约1.5 ml菌液。8,000 r/m离心1 min。弃尽上清。

③加入100 μL溶液I，彻底悬浮菌体。

④加入150 μL溶液II颠倒离心管数次，使细菌完全裂解，溶液透明。

⑤加入150 μL溶液III，颠倒离心管6-8次，可见白色絮状物产生，室温放置10 min，8,000 r/m离心10 min。

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⑥将420 uL结合缓冲液加入离心吸附柱中，然后，将步骤⑤中获得的上清液加入离心吸附柱中，混匀，8,000 r/m离心1 min。

⑦倒弃收集管内液体，在吸附柱内加入600 μL漂洗液，8,000 r/m离心1 min，洗去杂质，重复漂洗一次。

⑧倒弃收集管内液体，8,000 r/m离心2 min，除去残留液体。

⑨将质粒纯化柱放在一干净的1.5 mL离心管中，加入40 μL洗脱缓冲液至管内柱面上，放置5 min。

⑩8,000 r/m离心1 min，所得液体就是立即可用的超纯质粒。

电泳步骤：

①取待检测DNA 4 μL，加入0.5 μL加样缓冲液，混匀。

②将加入了加样缓冲液的待测样品加入加样孔中。

③打开电泳仪，调节电压至50 V，保持稳压。

④电泳约30min～，关闭电泳仪，小心取出凝胶，将凝胶放入凝胶成像仪中，观察电泳结果。

五 结果与讨论

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[实验四] 质粒的酶切与电泳鉴定

一 实验目的

掌握酶切及电泳的原理及方法，并学会如何分析图谱。

二 实验原理

利用一定的限制性核酸内切酶作用于载体质粒的特点位点，形成一定的粘性末端，具有互补碱基配对的外源片段DNA可接入到载体中从而使质粒携带外源片段DNA，通过转入受体细胞，使其具有所需的特性。质粒的酶切即是基于此原理。

电泳就是在电场作用下各种胶体颗粒的迁移。具有不同电荷密度的生物大分子将以不同的速度迁移，从而得到分离。

本实验采用琼脂糖凝胶作为介质，在一定的缓冲体系中依据迁移速度不同形成不同的条带，从而进行质粒的验证。

三 实验材料

1 酶切实验材料

质粒pUC19，本实验室构建，实验3提取。

限制性内切酶Sal I：宝生物工程（大连）有限公司产品，含酶20 U/μL，酶反应缓冲液H。 限制性内切酶BamH I：宝生物工程（大连）有限公司产品，含酶15 U/μL，酶反应缓冲液H。 pUC18 限制性内切酶用EcoR I：宝生物工程（大连）有限公司产品，包括酶15 U/μL，酶反应缓冲液H。

2 酶切产物的电泳实验材料和仪器

50×TAE缓冲液：Tris 242 g，冰醋酸 57.1 mL，0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 100 mL，定容至1 L。 TAE缓冲液：取50×TAE缓冲液10mL，加入纯水至500 mL。

溴化乙锭溶液：10 mg，加水至1 mL，充分溶解。

琼脂糖：华美公司分装Amresco产品。

电泳槽：迷你-31B型，北京六一仪器厂（含电泳槽，制胶槽）。

电泳仪：DYY-6B 稳压稳流电泳仪。

凝胶成像仪：美国alpha2200。

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四 实验步骤

（1）取已灭菌的500 μL离心管一支，用记号笔标上组号，依次加入质粒Puc19 17 μL，缓冲液H 2 μL，限制性内切酶EcoR I 1 μL，混匀。

（2）将上述溶液于37 ℃水浴60 min。

（3）取待检测DNA 4 μL，加入0.5 μL加样缓冲液，混匀。

（4）将加入了加样缓冲液的待测样品加入加样孔中。

（5）打开电泳仪，调节电压至50 V，保持稳压。

（6）电泳30 min~，关闭电泳仪，小心取出凝胶，将凝胶放入凝胶成像仪中，观察电泳结果。

五 结果与讨论

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[实验五] 酿酒酵母原生质体制备与观察

一 实验目的

（1）掌握原生质体的制备原理及方法。

（2）巩固显微镜的使用方法。

二 实验原理

原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。Zymolyase酶对酵母细胞壁有降解作用，破壁后的细胞缺乏细胞壁的保护及支持作用，呈球状且易进行细胞间的融合及遗传物质的交换。

三 实验材料

YEPD培养基：Trypton 20 g/L，Yeast Extract 10 g/L，葡萄糖 20 g/L。

Tris.HCl 100 mmol/L (pH 8.0)：取12.1 g 三（羟甲基）氨基甲烷于500 mL纯水中，用HCl调pH至8.0，定容至1 L。

EDTA.Na2 100mmol/L(pH: 8.0): 取EDTA.Na2.2H2O 37 g，溶于500 mL纯水中，以10％NaOH溶液调pH至8.0，定容至1 L。

高渗溶液：0.7 mol/L KCl 溶于TE中。

台式高速离心机 水浴锅

四 实验步骤

①接种酿酒酵母一环于2 mL液体YEPD培养基中，于30℃恒温摇床，培养12~16 h至对数期；

②8,000 r/m离心1 min收集菌体，用0.4 mL TE悬浮菌体；

③8,000 r/m离心1 min，用0.4 mL EDTA溶液悬浮菌体，静置10 min。8,000 r/m离心1 min，用0.4 mL高渗缓冲液悬浮菌体，8,000 r/m离心1 min，弃尽上清，用0.5 mL高渗缓冲液悬浮菌体。

④加入Zymolyase溶液20 μL，30℃水浴，10 min镜检一次，至大部分菌体变为球形；用数码相机拍下原有细胞和原生质体的形状。

五 结果及讨论

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[实验六] 酵母染色体DNA的提取

一 实验目的

熟悉并掌握染色体DNA提取的方法及原理。

二 实验原理

直接用制备好的原生质体，通过加TE使原生质体破裂，加入20L 10％ SDS溶液使蛋白沉淀，加5L核糖核酸酶（RNase）降解RNA。然后用氯仿--苯酚混合提取法提取染色体DNA。

三 实验材料

TE: Tris.HCl 10 mmol/L (pH 8.0), EDTA 1 mmol/L (pH 8.0)，Tris.HCl 100 mmol/L (pH 8.0) 100 mL、EDTA.Na2 100mmol/L(pH: 8.0) 10 mL用纯水定容至1 L

平衡酚：上海华美生物工程公司产品

含质粒的大肠杆菌

台式高速离心机

水浴锅

四 实验步骤

①取已经制备好的原生质体悬液，8,000/min离心3 min，用TE悬浮原生质体，过程中大部分原生质体将破裂，加入1/10体积10％ SDS溶液，5?L RNase（5mg/mL）65 ?C水浴20 min。

②加入等体积平衡酚，颠倒混合，放置5 min，8,000 r/min离心5 min，取上层液体至另一干净离心管中，加入等体积氯仿（氯仿：异戊醇＝24：1），颠倒数次，放置5 min，取上层水相至另一干净离心管中。

③加入2倍体积的无水乙醇，于-20 ?C放置1 h。

④12000 r/m，离心10 min，弃去上清液；加入适量TE溶解沉淀；

⑤电泳鉴定。

五 结果与讨论

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