电转法

设计方案一：

感受态制备：

1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜；

2. 取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm

培养约16-18h(OD:1.3-1.5)；

3. 于4℃离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤一次后，细胞用10ml冰无菌水重悬，可换成较小的离心管；

4. 加入1ml，pH7.5，10×TE缓冲液，摇晃均匀，再加入1ml 10×LiAc，旋转摇

匀，于30度轻轻摇动45min；

5. 再加入0.4ml 1 mol/L DTT，并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min；

6. 于4℃离心，弃上清（用枪吸），再用25mL冰无菌水洗涤；

7. 2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）；

8. 每管用100ul山梨醇溶解，分装于EP管中（80ul/管），于-70℃冰箱保存。 电转化：

1．向感受态细胞中加入约5～10ug（体积小于10 ul）的DNA，用枪吹吸均匀，

转移至预冷的电转杯中，静置5min；

2．擦干电转杯，电击，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆；

3．立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h；

4．离心，弃上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培养2h；

5．离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。

说明：该方法可直接采用50或100mL体系的一步法，即直接挑单菌落于YEPD中培养至预定菌浓，也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态。

设计方案二：

感受态制备：

1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜；

2. 取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm

培养约16-18h(OD:1.3-1.5)；

3. 于4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤后，细胞重悬

于8ml处理液中（处理液配方：100 mM LiAc， 10 mM DTT， 0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH 7.5），室温静置30min；

4. 4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用1.5mL 1mol/L预冷的山梨醇洗涤三

次，离心条件一样；

5. 每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山

梨醇），最后以80 ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部分），置于-70℃冰箱保存。

电转化：

1. 向感受态细胞中加入约3ug（体积小于10ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移

至预冷的电转杯中，静置5min；

2. 擦干电转杯，电击，电击参数：2.0KV，25uF，200欧姆；

3. 立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h；

4. 离心，弃上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培养2h；

5. 离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。

说明：处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。制备体系可按比例放大。

设计方案二特别适合于采用一步法制备感受态细胞

具体如下：

1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中或转接于50mL YEPD中，在30℃、

250-300rpm 条件下培养至OD=6-10（为防止菌体老化，可将50mL培养体系提早收获细胞，取菌体时，以1mL/次，取菌两次或三次不等，使用菌浓达到预定的OD:6-10）；

2. 取1mL菌液分装于EP管中，于4℃，120xxrpm离心30s，弃上清；

3. 收集菌体，用预冰的无菌水洗涤两次，离心条件一样；

4. 所得菌体用1mL处理液（配方同上）于室温下处理30min；

5. 离心，弃上清，加入1ml 1M 预冷山梨醇，离心，弃上清，重复两次；

6. 最终用1M 预冷山梨醇溶解菌体至终体积为80 ul，于-70℃冰箱保存；

7. 电转方法同上。

8. 每一步的离心均30s即可，在较短的时间内制备出的感受态转化效率特别高。

备注：OD检测均为600nm，空白参比为：YEPD，高浓测定时应稀释测定。所有无菌水与山梨醇均在冰上预冷处理；在制备感受态阶段，所有离心均在4℃条件下。

醋酸锂转化法

方案一：

1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、200rpm培养过夜；

2. 取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm

培养约5h(OD:0.5-0.8)；

3. 于4℃，5000rpm，5min离心收集菌体；

4. 25mL冰无菌水洗涤两次，离心条件一样；

5. 用1mL 0.1M LiAc悬浮，离心收集菌体；

6. 再用0.5mL 0.1M LiAc悬浮，以50 ul/管分装于EP管中，置于冰上备用；

7. 依次向上述50 ul感受态细胞中加入50% PEG3350 ：240ul、1M LiCl：36ul、

2mg/ml 单链DNA：50ul、转化DNA（5-10ug）：50ul；

8. 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；

9. 30℃水浴孵育30min；

10.42℃水浴热休克20～25min；

11.13000rpm离心30s收集酵母菌体，重悬酵母于1ml YEPD培养基，30℃摇床

孵育4h；

12.离心收集沉淀菌体，取除约800 ul上清液，然后按每100 ul/板进行涨涂板。 方案二：

1、接种液体YEPD培养基，过夜培养至1-2×107cells/ml；

2、取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm

培养约5h(OD:0.5-0.8)；

3、收集细胞，并用无菌水清洗，之后用1ml无菌水重悬，并转移到1.5ml离心

管；

4、1ml TE/LiAC（10×TE[0.1 M Tris-HCI,0.01 M EDTA,pH 7.5]；lO×LiAc[1 M

LiAc pH 7.5）清洗细胞，然后用1×TE/LiAC重悬至2×109 cells/ml；

5、1.5ml离心管中取50u悬浮液，用1ug转化片段和50ug单链鲑鱼精DNA混

合；

6、加入300ul灭菌的40%PEG溶液，剧烈混匀；

7、30度振荡培养30min；

8、42度水浴热击15min；

9、离心5s，用1ml 1×TE重悬，适当稀释后涂布于选择培养基。

附：

电转法方案二中的处量液配制方法：

1. A液成份：100 mM LiAc，0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH 7.5；配制量：

500mL。

1.1 称取54.654g山梨醇，用适量dd无菌水溶解于500 mL容量瓶中；

1.2 事先配制1 M LiAc母液，再从LiAc母液中取50mL至1.1所述容量瓶中；

1.3 事先配好1M Tris-HCl（pH 7.5），再取5mL至1.1所述容量瓶中；

1.4 用dd无菌水定量至500mL，转移至试剂瓶中，于4℃保存。

2. B液成份（母液）：1 M DTT 配制量：20mL。

2.1 称取3.09g DTT，加入到50mL小烧杯内；

2.2 加入20 mL的0.01M NaOAc(pH5.2)，溶解后使用0.22um滤器过滤除菌；

2.3 适量分成小份后，-20℃保存。

3. 在使用时按每50mL菌体量用8mL处理液（A+B）。以50mL菌体为例：取A

液8mL ，再取80ul 1 M DTT 于小三角瓶中混匀，备用。

 

第二篇：总结几种提升网站pr的方法

总结几种提升网站pr的方法

第一种：大量的首页链接，关注了好几个这样的站，网站首页大约有几百个首页链接，对方也都是首页链接这个站，类似这样的站pr都是5，6了。第二种：首页只有不到30个外链，pr也可以到5。

个人总结：

第一种方法有一个条件就是他一般是高级别链接低级别，比如他首先要有一个pr3的站点，那么他大量地找pr1，2或者新站做首页交换一般低级别或新站是愿意交换的，所以他首页基本每天都在交换，都在加链接，那么快照也是最新的，有些站为了更新自己网站快照，尽管对方链接多，也就答应交换，况且对方pr也比自己的高，所以成功率很高，这是完全靠量堆起来的。

第二种方法，一般是正常的更新内容，只做与自己pr差不多的网站，比如自己pr4，那么只链接pr3或者4，5的站，他的pr也可以提升，需要说明的是这样方法一般适用于网站还不错，不只是内容，还有整个站的设计风格是否大气或者专业，这个没有具体数据，但是观察了几个这样的站，pr确实都升到4，5了，而且排名一直都是首页,这里要说到一个Google信任指数问题。(Google TrustRank具体参考http://www.zhichuang126.com/)是一个对网站排名有重大影响的参数，重要性超过PR值。一旦网站进入他的信任里，排名和pr其实是很容易的，而整站专业和大气是更容易进入信任里的。百度其实也有一个信任机制，曾经有一个5年老站，空间挂了，连续2个多月近3个月都无法访问，一般的站，这时候就K没了，而这个站收录量只是减少了三分之一，并不是全部K掉，说明这个网站在百度信任指数里非常高，而且当重新开通后，当天就开始收录新内容，想办法让自己的网站加入信任区域，也是有效提升排名和pr的方法。

这里可以看到：第一首页链接很重要，第二有些人不屑于交叉链接，其实交叉链接也是不错的，与大站或高pr的交叉链接，有时可以把站pr带起来的。

第三 外链导出数量是一个衡量指标。并非全部的外链越多就越能提升pr，上面的第一种方式，有很多都是维持在一个水平，比如1个pr5的站加了几百个首页交换链接。 pr更新时保持pr5的几率要比升到pr6的几率大很多，第二种方式，只有不到30个外链，但是从pr5升到pr6的几率与pr保持在5不变的几率是差不多的。

第四 也是自己的经验，一个站pr4，一直不怎么更新，首页外链十几个，在pr更新前的20天左右，开始更新，基本还是一个星期一篇到2篇文章，首页外联加到了30个，结果pr更新到5了。在pr更新前的20天左右时间里对自己网站进行集中处理，是提升pr的有手段，其他时间可以逐渐增加外链(比如博客，论坛签名，网站目录等)，而不是首页外链，当然，稳定地增加首页外链更好。

第五 千万不要同IP的互链，GOOGLE对这个审查力度比以前大多了，认为你pr作弊，很可能pr清零，如果实在想用自己同IP的站点来带新站，那么这个网站一定要加一些不同的IP的站的其他链接(强烈建议和对方首页互换，而不是自己随便加了别人而别人没加你)，

以此来降低危险系数，另外同IP站点相连被惩罚的很可能是那个新的被链的站点，老站点可能不会降，因为老站点有权重，可以抵御一定的惩罚，另外你的意图很明显，就是要老站带新站，那么引擎就是把你的新站pr清零，让你目的达不到，一般一年以下，收录很少的新站容易被惩罚。

第六 上面的第2种方式，要求链接一定要稳定，就是保持你做上对方的链接后对方也一直做着你的链接，持续几个月或1，2年不变，这个长期投票的系数似乎是考验网站权威的一个指标，对提升pr很有效。

第七 链接加相关性的，比如是做地方站的，那么加的首页链接都是地方相关的链接，这样一是相关性，二是多了关键字，有利于排名。对于单纯提升pr，首页外链不相关性可能更接近搜索引擎的自然发展理论，都是相关的了，自然就知道是刻意的了，引擎并不傻，似乎不相关的对于pr提升更有效。

第八 任何方法都不是唯一的，切忌这一点，如果你对以上观点的哪点不认同是正常的，不同人的理解和手段是不一样的。任何事情只有做了才知道到底是什么。整天见有人问我这样做会不会被惩罚，那样做会不会有问题，我想说的是，你不去尝试，你永远不会进步。

有人为自己从来没有被K，被惩罚而得意，有时我就在想：你没有被K过，被惩罚过，你其实是不知道搜索引擎的底线在哪里的。看了别人的文章，你觉得不错，认为就是这个样子了，其实事实也许并不是那样的，一个合格的seo，至少要有过3次以上的K站经历，5次以上的降权经历，你才知道哪些是要注意的，哪些是可以更进一步的。

第九 现在所谓的引擎排名的几个指标啊，权重分配，其实都是前辈经过无数次试验得来的，他并不是引擎的根本，哪个引擎也不会公布自己的核心算法，而且算法也是在不断调整的，所以只有不断地尝试，才知道什么是可以做的。任何一两个因素也不是引擎排名提升或整站权重提升的唯一因素，信息多样化了，衡量指标也就多样化了，但是pr，正常的反向链接是越多越好这是肯定的，但一个没有信任权重的网站，有了过多的反向链接是危险地。 下载地址：百度http://www.askdaifu.com/ http://www.jiuzhou83.com/