分子免疫学实验报告

免疫电泳实验报告

摘要 ：本实验运用火箭电泳、微量电泳、双向免疫扩散等方法测定抗体的效价。

关键词 ：抗体效价测定 ； 火箭电泳 ； 微量电泳； 双向免疫扩散

1 前言

免疫电泳(immunoelectrophoresis)的方法很多，主要有单向免疫扩散、双向扩散电泳、对流免

疫电泳、微量免疫电泳、免疫火箭电泳、免疫固定电泳等几种方法。其中比较常用方法有以下三

种。

火箭免疫（rocket immunoelectrophoresis），该方法是在琼脂板内掺入适量的抗体，在电场的

作用下定量的在含适量抗体的离子琼脂中泳动，当走在前面的抗原遭到琼脂板内的抗体时，形成

抗原体复合物而沉淀出来，走在后面的抗原继续在电场的作用下向正极泳动，在向前泳动过程中，

遇到了前面抗原所沉淀的抗原抗体复合物，由于抗原的增加造成抗原过量时复合物沉淀溶解，并

一同向正极移动而进入新的琼脂板内与未结合的抗体结合，有形成新的抗原抗体复合物沉淀出

来，这样不断地沉淀—溶解—再沉淀，直到全部抗原与抗体结合，当比例合适时，可在短时间内

出现锥形沉淀线，此沉淀线形似火箭，故称火箭电泳，抗原含量越高所形成的火箭峰愈长，因此

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实验七 对流免疫电泳

一、 实验目的

掌握对流免疫电泳原理及操作方法。

二、实验原理

在偏碱性的缓冲液和适当的直流电场中，抗原和抗体的扩散具有一定的特点。在pH8.6以上的缓冲液中，大部分蛋白质抗原解离带负电荷，在电场中向正极泳动；而大部分抗体属于IgG，在此种pH条件下只带微弱的负电荷，由于其分子量大，暴露的极性基团少，在电场中泳动缓慢，且受电渗作用的影响，带正电荷的液体推动抗体分子向负极泳动。由此抗原、抗体就达到了定向对流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的白色沉淀线。

三、实验器材和材料

? 试剂：

人甲胎蛋白、抗人甲胎蛋白抗体、 pH8.6 0.05mol/L巴比妥缓冲液 、用巴比妥缓冲液配置1%琼脂 。

? 仪器：

电泳槽、电泳仪、水浴箱 。

? 材料：

孔型模板、打孔器、滤纸、纱布条、微量加样器、载玻片、吸管、吸球等 。

四、实验方法

? 制备巴比妥琼脂凝胶：取出一清洁载玻片，用75%乙醇冲洗干净，晾干备用。将1%巴比妥琼脂融化后，置56℃水浴中备用。用吸管吸取4~4.5ml琼脂溶液滴加于玻片上，室温放置，待凝固后打孔，孔径3mm，孔距10mm。封底。

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鸡传染性法氏囊病对流免疫电流

一 对流免疫电泳是利用电场力的作用和抗原抗体特异性结合的原理发展起来的一种快速诊断方法，与传统的琼脂凝胶沉淀实验相比。它具有快速，敏感、特异等优点。我们利用自制的诊断抗原、抗体建立了鸡传染性法氏囊病的对流免疫诊断方法。建立诊断鸡传染性法氏囊病的对流免疫电泳（CIE）技术。实验结果证明，该法的敏感性较琼脂凝胶沉淀实验至少高4倍，并具有快速 敏感 特异等特点。鸡传染性法氏囊病（IBD）是一种有传染性法氏囊病毒引起的急性高度传染性疾病。肉鸡感染后死亡率很高，通常死亡率约为10％--90％，如有发其他疾病，则死亡率更高。早起快速准确的诊断是防止本病的基础。

二 材料与方法

自制的抗原 抗体

(一) 电泳琼脂板的制备

1 先用蒸馏水配1﹒5％琼脂糖，水浴加热融化后，加入1/2量的预热至70 ℃左右0.075mol/L、PH 8、6的巴比妥缓冲液。最终琼脂糖为1％，PH 8、6，离子强度0,025 mol/L，混合后趁热铺于干净的载玻片上（7．5cm×3．5cm），厚3mm。注 制板前载玻片一定要洗干净，在4℃下处理10—20min.加琼脂时动作要快，使琼脂间不要出现明显的界限。

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对流免疫电泳

（一）原理

将抗原和抗体分别加入半固体琼脂孔内，在碱性缓冲液中进行电泳时，蛋白质抗原带负电荷，在电场中由阴极向阳极移动。抗体等电点较抗原高，在此缓冲液中带阴离子少，分子量大，泳动较慢，同时因电渗作用（电渗是电场中溶液对于固体的相对移动，琼脂是酸性物质含有较多的硫酸根，在碱性缓冲液中带负电，而与它接触的溶液带正电，因此液体向阴极移动，产生电渗），反而向阴极泳动，这样就使抗原、抗体在电场中相对移动，而形成对流。经过一定泳动时间后，在比例最适处，形成肉眼可见的白色沉淀线。由于电场作用，限制了抗原和抗体多方向的自由扩散，加速了泳动的速度，缩短了反应时间，提高了灵敏度。

（二）器材与试剂

1．器材

（1）电泳仪、电泳槽（2）载玻片（3）刻度吸量管（4）打孔器和图形卡

（5）毛细管（6）吸耳球（7）煮沸消毒水浴箱

2．试剂

（1）1.2％琼脂凝胶（2）生理盐水（3）抗原（4）抗体

（5）pH8.6 0.1M巴比妥缓冲液

（三）操作步骤：

1．取热熔的1.2％琼脂凝胶3.5ml，立即浇于载波片上，使琼脂平铺于整个玻片。待自然冷却凝固。

2．用打孔器按图形打孔，再用针尖挑去孔内琼脂。

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免疫电泳技术

将可溶性抗原（如人血清蛋白） 与相应抗体（如兔抗人血清的抗体）混合，当两者比例合适并有电解质（如氯化钠、磷酸盐等）存在时，即有抗原-抗体复合物的出现，此为沉淀反应。如以琼脂凝胶为支持介质，则在凝胶中出现可见的沉淀线、沉淀弧或沉淀峰。根据沉淀的出现与否及沉淀量的多寡，可定性、定量地检测出样品中抗原或抗体的存在和含量，免疫学的一些测定方法即基于此特性。

抗原与抗体的结合在沉淀反应中，呈一定的分子比例。不同抗原和抗体之间的分子比例是不同的，但只有在分子比例合适时，才出现可见的沉淀。所以沉淀能否出现并不完全反映抗原和抗体是否存在和发生结合。抗原结合多个抗体分子，称抗原为多价；抗体一般只能结合两个抗原分子（IgM类抗体分子通常可以结合5个抗原分子）的抗原决定法簇，故为二价。只有在彼此的结合价饱和时，才出现大量的抗原-抗体复合物沉淀。

当抗原与抗体的比例合适时，即二者结合价彼此饱和，就可形成网状结构的大分子抗原-抗体复合物沉淀，称为等价带。若比例不合适时，抗体或抗原过量，则虽有抗原、抗体的结合，但不能大量形成网状结构的大分子复合物，沉淀量很少，甚至不出现沉淀。在抗原、抗体数量关系曲线中，抗体过剩区域称为抗体过剩带，抗原过剩区域称为抗原过剩带。如图1所示，在等价带的反应液中加入过量的抗原或抗体，沉淀复合物就会有部分溶解，甚至全部溶解的现象。这是由于新加入的抗原或抗体竞争地结合相应的抗体或抗原，使网状大分子结构破坏，形成小分子复合物，致使沉淀出现溶解，沉淀量减少甚至完全消失。在沉淀反应中，由于抗原过量而不出现沉淀的现象，称为前带现象。此时不能误认为无沉淀就是无抗原存在，为了检测就必须稀释抗原。抗体过量时，称为后带现象，同理需要稀释抗体进行检测。

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实验复习题及答案

一、选择题：

1.夹心ELISA法检测HBsAg时，用于包被固相载体的物质是(C)

A. 纯化的HBsAg B. 酶标记的HBsAg C. 纯化的HBsAb

D. 酶标记的HBsAb E. 辣根过氧化物酶

2.间接ELISA法检测HBsAb时，用于包被固相载体的物质是(A)

A. 纯化的HBsAg B. 酶标记的HBsAg C. 纯化的HBsAb

D. 酶标记的HBsAb E. 辣根过氧化物酶

3. 血型鉴定实验时，待检红细胞悬液与抗A抗体混合发生凝集，与抗B抗体混合未发生凝集，则待检血的血型是(A)

A. A型 B. B型 C. AB型 年 D. O型 E. 不能确定

4. 血型鉴定实验时，待检红细胞悬液与抗A抗体混合不发生凝集，与抗B抗体混合发生凝集，则待检血的血型是(B)

A. A型 B. B型 C. AB型 年 D. O型 E. 不能确定

5.不属于人工主动免疫制剂的是(C)

A.乙肝疫苗 B.白喉类毒素 C.破伤风抗毒素 D.百日咳疫苗 E.脊髓灰质炎疫苗

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医学免疫学实验指导

供基础、预防、口腔、麻醉、药学、临床医学类专业用

泸州医学院

二零##年六月

目录

机体的天然免疫…………………………………………………………………………………（）

实验一、溶菌酶的溶菌作用………………………………………………………………（）

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《免疫学实验》复习题

名词解释

1、      多克隆抗体：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。

2、      免疫血清：

3、      再次应答：

4、      补体溶血反应：由于抗原（红血球）和抗体（溶血素）进行特异性的结合，在电解质存在时能发生凝集，若再有补体参与，红血球则被溶解。

5、      ELISA：

6、      直接凝集反应：细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集反应。

7、      间接凝集反应：将可溶性抗原（或抗体）先吸附或偶联与免疫无关大小适当的颗粒性载体的表面，使之成为致敏载体颗粒，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象，称间接凝集反应或被动凝集反应。

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