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运用薄层色谱法对氨基酸分析实验的改进 作者：林 珊

来源：《职业·中旬》20xx年第01期

薄层色谱法(thin layer chromatography,TLC)是20世纪50年代从经典柱色谱法和纸色谱法基础上发展起来的一种色谱技术,是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术,属固-液吸附色谱。薄层色谱法操作简便、快速、灵敏、分离效果好、显色容易,在生物化学与分析实验中广泛应用于氨基酸、多肽、核苷酸、脂类、类、生物碱等多种物质的分离和鉴定。但在氨基酸分析实验中,常出现显色效果不好及拖尾的现象,为改变以上现状,我们经过多次实验,提出以下方案。

一、氨基酸薄层色谱茚三酮显色的改良

薄层色谱是将固相支持物(也叫吸附剂)均匀铺在玻璃板上使之成为薄层,将待分析的样品点到薄层板的一端,然后将点样端浸入适宜的扩剂中,在密闭的层析缸中展层。由于各种氨基酸的理化性质(分子极性、分子大小和形状、分子亲和力等)不同,其在吸附剂表面的吸附能力各异。当展开剂在薄层板的毛细管中移动时,点在薄板上样品的组分就不同程度地随着展开剂移动,使不同的氨基酸得以分离。

由于吸附剂在喷雾显色时,常见层析表面破坏,造成分析困难,经过多次实验发现,若不采用喷雾法,而直接将展开剂与喷雾剂同时使用,不但便于操作,氨基酸斑点清晰,边缘整齐,薄层面光滑完整,而且比移值也保持不变。

1. 仪器

硅胶G薄层板、毛细管、层析缸、电吹风、喷雾器、烘箱。

2. 试剂

硅胶G;黏合剂:0.5%的柠檬酸与1%的羧甲基纤维素钠混合,煮沸至无气泡,冷却静置分层后用;氨基酸溶液:0.5%的脯氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸以及混合溶液;展开剂:V正丁醇:V冰乙酸:V水=4:1:2;展开显色剂:V展开剂:V0.1(0.1%茚三酮无水丙酮溶液)=10:1。

3. 操作

(1)薄层板的制备。①调浆:称取硅胶14 g,加黏合剂25 mL,置于研钵中充分研磨成均匀的膏状;②涂布:取两块洁净的干燥玻璃板(20×20)置于涂布器上均匀涂层。(请询问作者20×20的单位是否是20 cm×20 cm,没有单位的数值没有意义)③干燥:将玻璃板水平放置,室温下自然晾干。④活化:晾干的薄层板置于烘箱内,105℃活化30 min,切断电源,待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。

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(2)点样。活化后的硅胶板室温冷却后,在距底边2 cm水平线上均匀确定5个点。用毛细管分别吸取氨基酸溶液,轻轻接触薄层表面,每次加样后原点扩散直径不超过3 mm,干后再点一次。

(3)展层。在层析缸中加入展开显色剂1 cm厚,加盖平衡0.5 h。将薄层板点样端浸入展开显色剂,展开显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖,上行展层。当展层显色剂前沿离薄板顶端2 cm时,停止展层,取出薄板,用铅笔描出溶剂前沿界线,用热风吹干,即可出现氨基酸显色斑点。

二、改善氨基酸薄层色谱的拖尾

拖尾现象是指展层,显色后在层析分配图上,所看到的某一种氨基酸的分子位移,不像标准图谱那样完整地显示在某一位置上,而是前端粗圆而逐渐细小下来,宛如拖着一个尾巴,其图所呈颜色也是由浓渐淡。

1. 拖尾现象原因分析

氨基酸薄层色谱拖尾的出现,原认为是对影响Rf的主要因素[如物质结构、极性、层析溶剂、溶剂和样品的pH、温度、薄层的质地是否均匀、薄厚是否适当、硅胶的松紧度是否适中、展层的方式(上行、下行)等]掌握不够所致。然而多次实验证明,无论操作如何严格都仍不可避免地出现拖尾现象。经分析,样品的处理是为纯化,实现层析分配某氨基酸的清晰显色图像;展层使样品达到一个适当的位移,便于在显色后从图像上区分不同样品的氨基酸;显色剂含水量极低,不会影响洋品的斑点扩散,那么问题就集中在点样这个操作程序上了。

2. 拖尾改善方法

(1)点样位置。为了对照实验结果,而分别配制的几种氨基酸的溶液,用微量点样管或毛细管,点在以硅胶为惰性支持物的层析板上设计好的多点位置中去。

(2)风干样品。点样后要自然风干,或冷风吹干。因为一旦控制不好温,势必要使样品破坏,样品点太干燥,样品物的分子牢固吸附在层析板上。所以在展层过程中,样品点的每个物质分子不能在层析板上同时起步,而是形成了有先有后,鱼贯而上行或下行的状况,致使在显色后,实验结果的图像上,观察到的不是一个完整的斑点,而是一个拖着尾巴的斑点。这就是上述所说的拖尾现象。

(作者单位:海南省高级技工学校)

 

第二篇：薄层色谱法在药物分析中的应用

1 薄层色谱法概述 ............................................................................ 2

1.1 定义 ....................................................................................... 2

1.2 原理 ....................................................................................... 2

1.3 特点 ....................................................................................... 2

1.4 定量检测方法 ......................................................................... 3

2 TLC在药物分析方面的应用 ............................................................... 3

2.1 中药材的鉴别 ......................................................................... 3

2.2 植物药成分的鉴别 ................................................................... 4

2.3 化学药品及复方制剂 ............................................................... 5

2.4 药品杂质检验 ......................................................................... 6

2.5 中药指纹图谱分析 ................................................................... 6

2.6 在定量分析中得应用[13] ........................................................... 7

2.6.1 薄层色谱定量方法 ......................................................... 7

2.6.2 薄层色谱在定量分析中得应用 ......................................... 8

3 薄层色谱新技术及其应用 .................................................................. 8

3.1 高效薄层色谱（HPTLC） ......................................................... 8

3.2假相薄层色谱 .......................................................................... 9

3.3 反相薄层色谱( RPTLC) .......................................................... 10

3.4 薄层扫描法[17] ....................................................................... 11

4 总结 .............................................................................................. 12

薄层色谱在药物分析中的应用

薄层色谱( Thin Layer Chromatography，TLC) 在药物，尤其在植物药成分的定性和定量分析方面早已有了非常广泛的应用。随着科学技术的发展以及新材料的应用，使其得到了很大发展，出现了许多新技术，如高效薄层色谱、假相薄层色谱、反相薄层色谱、微乳薄层色谱在中药药物分析中已有一定的应用。TLC 在规范化、仪器化方面均取得了长足的进步，在大批量样品及某些特殊样品的快速分析中，显示了分析容量大、可采用特征专属的显色剂以及极低的溶剂消耗等优势。近年来TLC 广泛应用于有机化合物的分析鉴定、植物药有效部位的分离精制、有机合成、结构分析、生物测定等，尤其在研究开发植物药有效部位和中成药质量控制中，是用于定性、定量分析的最简便的科学方法。但TLC亦有其缺陷，其色谱结果易受铺板质量、点样技术、展开剂配制、层析环境中展开剂的饱和度、环境温湿度等因素的影响， 有时难于重复；显色又受均匀性、灵敏度、稳定性等影响，这均使测定结果偏差较大[1]。最近几年围绕着测定过程的标准化和自动化，薄层色谱技术有了全新的发展， 扩大了TLC技术在中药药物定性定量分析中的应用。

1 薄层色谱法概述

1.1 定义

薄层色谱法（TLC）系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上, 成一均匀薄层。待点样，展开后, 根据比移值(Rf) 与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值(Rf ) 作对比， 用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。

1.2 原理

薄层色谱法是一种吸附薄层色谱分离法，它利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在移动相(溶剂) 流过固定相(吸附剂) 的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附, 从而达到各成分的互相分离的目的。

1.3 特点

薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，也

用于跟踪反应进程，它可以同时分离多个样品，分析成本低，对样品预处理要求低，对固相、 展开剂的选择自由度大，适用于含有不易从分离介质脱附或含有悬浮微粒或需要色谱后衍生化处理的样品分析。TLC 法是一种快速、灵敏、高效地分离微量物质的方法，是最简单的色谱技术之一，具有操作方便，设备简单， 分离效率高，专属性好，分析速度快，色谱参数易调整等特点，在药物分析中应用较为广泛。

1.4 定量检测方法

（1）吸收测定法对在可见及紫外光区有吸收的化合物可用钨灯和氖灯在20-800nm 范围进行透射和反射吸收法测定。

（2）荧光测定法化合物本身或者经过色谱前和色谱后衍生化生成对紫外有吸收并能放出更长波长的化合物适用荧光法测量, 荧光法灵敏度高。

（3）荧光淬灭法本身无色、又无特征紫外吸收或荧光，并且不易衍生的化合物可采用荧光淬灭法测量，使用含有荧光剂的薄层板 [2]。

2 TLC在药物分析方面的应用

2.1 中药材的鉴别

用薄层色谱进行指证性鉴别，它们之间的关系是共性与个性的关系。制备试药生药-共性化合物-共性特征(指示性的) 薄层色谱个性化合物个性特征(Rf值、颜色)薄层色谱为生药提供了一个可信的“身份”，它可以提供分子水平上的鉴别作用， 从而确定是不是认定的生药，是不是道地的生药，是不是已失效的生药。中华人民共和国药典2005 版一部规定，人参和西洋参的鉴别必须使用薄层色谱法。取人参及西洋参粉末各19，制成供试品溶液；另取它们的对照药材19，同法制成对照药材试液，再取人参单体皂普Rbl 、Re、Rgl、Rf 和拟人参皂昔Fll 制成对照品溶液，于同一硅胶G薄层板上进行色谱层析，规定供试品谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，在日光及紫外光(365nm) 下，分别显相同颜色的斑点或荧光斑点。在这里我们可以看到，人参分子特征是人参皂营单体，其伪品异类不具备这种分子个性特征, 而且同属不同种的人参和西洋参分子特征亦不同，人参特含皂普Rf， 而西洋参则特含拟人参皂昔Fl l 。这在某种程度上给我们规定了人参特征谱系。这种分子的不同、谱系的不

同，就区别了药材的异同[3]。黄玉清[4] 采用TLC 鉴别牡丹皮及其伪品芍药根皮，取牡丹皮、芍药根皮粉各1g， 用乙醚提取后挥发，残渣加丙酮溶解，作为供试液；另取丹皮酚、芍药苷分别加丙酮溶解制成对照液，分别点于同一硅胶G 板上, 以环己烷- 乙酸乙酯( 3：1) 为展开剂。展开后，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇溶液，牡丹皮供试液与丹皮酚对照液位置上显相同的紫色斑点，芍药根皮供试液与芍药苷对照液相应的位置上显相同的蓝色斑点。

在中成药及其复方制剂方面，赵志军等[5] 建立了益康胶囊的T LC 鉴别方法，对方中组成药物人参、黄芪、何首乌、丹参及甲基橙皮苷进行鉴别。结果，斑点清晰，分离效果好，专属性强，阳性对照无干扰。金阳[6]研究破壁灵芝孢子粉胶囊的TLC 鉴别方法, 通过对集中提取及展开系统的比较，对破壁灵芝孢子粉的鉴别选择GF254 板，用石油醚( 60℃~ 90℃) - 甲酸乙酯- 甲酸( 15：5：1) 的上层溶液为展开剂。结果，鉴别效果好，能很好地把破壁灵芝孢子粉和灵芝区别开来。

2.2 植物药成分的鉴别

TLC 法在植物药成分鉴别方面的应用已极为广泛。印度M.S.大学的Murthy 等[7]在2008 年首次报道了关于莕菜属植物Nymp hoides macrospermum Vasudevan中桦木酸(betulinic acid)的TLC检测方法，该方法将2.5g N. macrospermum 根粗粉用25mL甲醇溶液水浴加热回流提取30min，同法提取4 次后合并提取液，滤过、离心后制成一定浓度的甲醇溶液。将该样品溶液与桦木酸甲醇对照液同时在TLC 硅胶G60 F254 预制板上点样，用环己烷2醋酸乙酯2冰醋酸(7 ∶3 ∶0. 03) 溶剂系统展开， 30 min 后取出吹干，用茴香醛2硫酸溶剂喷淋， 110 ℃加热3 min 显色，斑点在紫外2可见光下检视，结果显示分离效果良好，Rf = 0. 60。该方法在桦木酸的检测方面以快速、简便、准确的特点优于其他方法。

新德里生物技术研究所的Ram 等[8] 在对多种药用植物的研究中建立了一种甲羟戊酸(mevalonicacid) 的快速TLC 检测方法,实验对象包括黄花蒿Artemisi a annua L.、补骨脂Psoralia corylifolia L . 、长春花Vinca rosea L . 、催眠睡茄Withani asomnifera (L.) Dunal、黄叶假杜鹃Barleria prionitis L . 等药用植物的叶，方法采用硅胶G60 F254预制板，展开系统选用苯2丙酮(3:2) ，先将薄层板在甲醇中浸泡1 h 去除杂质，干燥后备用。粉碎的植物叶片用色谱纯醋酸乙酯提

取，与对照品醋酸乙酯溶液同时点样展开，室温30 ℃，相对湿度55 %，衍生试剂为0. 05 mL/ mL 茴香醛醋酸溶液-乙醇-97 %硫酸(10:85:5) ，110 ℃下加热5 min 显色。该方法简单、快速、灵敏度高。布达佩斯的Ligor 等研究了多种茶叶中活性物质黄酮类的TLC 检测方法,提出将经典液相萃取提取方法(LE) 和超临界液体萃取法(SFE) 作比较，并用TLC 法检测在不同提取方法下活性成分的量。

2.3 化学药品及复方制剂

近年来TLC 法以其快速、简便、准确的特点，在化学药物成分的研究中仍有很多应用。波兰J agiellonian 大学的Starek 等利用TLC 法对抗炎药吡罗昔康的多种剂型及其降解产物进行了研究测定，其中，胶囊和注射剂用丙酮溶解，片剂在0. 5 mol/ L的盐酸溶液中水浴加热至60 ℃，再制成丙酮溶液。该方法的展开系统为醋酸乙酯-甲苯-氨基丁烷(2 :2:1)，紫外吸收法测定检测波长360nm。研究结果表明，吡罗昔康的稳定性良好，不易降解，且在碱性环境下比酸性环境更稳定，其降解产物为嘧啶-2-胺和2-甲基-2 ,3-二氢-4 H-1 ,2-苯并噻唑-1 ,1 ,4-三酮。该方法稳定可靠，快速准确，可用于该类药物的分析鉴定。

波兰Jagiellonian 大学的 Ekiert 等 用TLC测定唑类抗真菌剂，这是抗真菌唑类药物成分检测的新方法，目前鲜有报道。该实验对酮康唑、联苯苄唑、氟康唑和伊曲康唑4 种抗真菌剂进行了测定，前3 种用甲醇溶解定量，伊曲康唑用氯仿溶解，并制成甲醇溶液。经选择TLC 板用硅胶60F254 荧光板，展开系统选用正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸 (42:40:15:2:1)，UV检测波长260nm。该法准确简便，专属性强，可作为抗菌素类药物TLC 法研究的参考。

药品的亲脂性是指某分子或分子的一部分对类脂环境的亲和性，有机化合物的亲脂性可以影响它们的吸收、分布、代谢和排泄等，所以药品的亲脂性研究对于药品的生物利用度的预测有着重要意义。传统的亲脂性研究是用液-液分配的方法测定，比较费时繁琐，反相TLC 法亲脂性研究方法的引入解决了这一问题。Hamryt [8] 等用RP2TLC 方法研究了12 个精神类药物的亲脂性。选用Merck C18 硅胶F254HPTLC 薄层板(10 cm ×10 cm)，考察了多种流动相组合，结果表明最好的流动相为：甲醇-水-0. 01 mol/L SDS-10%醋酸盐缓冲液(pH

4.75) 、醇-水-1 %氨水、乙腈-水-1%氨水和二氧六环-水-1%氨水；而Cserely等用相对于反相TLC 板便宜的石蜡油涂层的硅胶板研究了12 种血管紧张素转化酶

抑制剂(ACE) 的亲脂性，其薄层板的制备方法为： TLC 硅胶板用10%石蜡的正己烷溶液连续展开18 h ，以石蜡油饱和TLC 硅胶颗粒涂层，板经干燥后在48 h 内使用，流动相则选择不同比例的乙腈-水-氢氧化铵溶液，用样品的Rf 值计算相应的亲脂性。

2.4 药品杂质检验

有关物质检查通常采用色谱法，可根据有关物质的性质选用专属性好，灵敏度高的薄层色谱，高效液相色谱(HPLC ) 及气相色谱(GC ) 法。薄层色谱法设备简单，操作简便，但因影响重现性和精密度的因素较多，可用作一般有关物质检查。采用反相薄层色谱法， 建立了阿德福韦酷有关物质检查法。以反相高效F254 薄层板 (HPTLC RP18 F254) 为吸附剂，以甲醇一水(3 :1)为展开剂，在紫外光灯254nm下检视，阿德福韦醋与其有关物质的分离状况良好，检测灵敏度高，最小检测限为0.1微克。采用薄层色谱法，建立了雌三醇栓中有关物质的检查方法，以硅胶G 板为吸附剂，以氯仿-甲醇-丙酮-冰醋酸(9 :0.5 :0.5 :0.5)为展开剂，展开后，晾干，喷以30%硫酸乙醇液，在100℃加热至斑点清晰。结果3 种有关物质与原药完全分离，Rf 值适中，最低检出量为0.2 p g，且重复性好。采用薄层色谱法检查复方氨酚烷胺颗粒中的有关物质(对氯苯乙酞胺)，使用0.5% 梭甲基纤维素钠(CMC ) GF 254 硅胶板，以氯仿-丙酮-甲苯(13 :5 :2) 为展开剂，紫外光灯254nm 下检视，结果检出对氯苯乙酞胺杂质斑点与其它主药成分斑点分离良好, 空白样品溶液的斑点对杂质斑点无干扰，重现性好，f 值适中，能有效检出有关物质[2]。

2.5 中药指纹图谱分析

中药指纹图谱可有效反映中药成分的复杂性，表征中药质量。其作为中药质量标准的一个方面，广泛用于鉴别样品的真伪或产地，有效成分研究等方面

[10]。色谱法是中药指纹图谱的主流，主要有GC、HPLC、T LC 等。TLC 因其便宜、快速、开放性、灵活性等优点，用于中药指纹图谱分析。TLC 的一大优势是提供直观形象的可见光或荧光图像，特征图像直观，专属性好，判断速度快，非常适合基层日常分析与现场检验使用。广藿香主要含萜类、黄酮类、醇、酸、铜、醛类等化合物，广藿香不同提取部位具有不同的药物效应。袁旭江等[11]研究不同产地广藿香药材薄层色谱指纹图谱的差别，取不同产地广藿香

样品6 个，采用T LC 检测其化学成分。结果，不同产地广藿香挥发油部位中成分薄层色谱行为相似，不同产地广藿香甲醇提取部位与石油醚提取部位成分则存在明显差异。薄层扫描仪具有原位扫描功能, 通过测量薄层色谱Rf 值，原位紫外- 可见吸收光谱，结合板上化学特征反应形成薄层扫描中药指纹图谱。崔淑芬等[12] 使用薄层扫描法测定不同品种和产地的甘草并建立了指纹图谱，可快速判断药材品质，有效控制甘草质量。

2.6 在定量分析中得应用[9]

2.6.1 薄层色谱定量方法

混合物在薄层上经过展开及用适当方法定位后可获得一个或多个斑点，根据斑点的颜色和在薄层上的位置( Rf 值) 可对样品进行定性分析， 此外对斑点还能进行半定量或定量分析。常用的定量方法有目测法、斑点面积法、洗脱测定法和薄层扫描法等。

目测法是将试液与一系列不同浓度的标准溶液并排点样于同一薄层上， 层析展开后比较各斑点的大小及颜色的深浅，可藉以估计某一组分的大概含量。目测法只是一种半定量方法，它只能作初略的定量，如在进行大批未知量的样品测定前，可用该法估计样品中欲测组分含量，为正式定量提供合理的点样量。斑点面积法薄层上斑点的面积与含量之间存在一定关系，因此测量斑点面积可以定量；斑点面积和含量之间的关系曾有不少报道，概括起来有以下几种不同的线性关系， 即lgw-A 呈线性关系， lgw-A 呈线性关系，lgw-lgA 呈线性关系。

究竟哪一种线性关系适合所测定的试样，需通过试验来确定。斑点面积的测量可用面积测量仪，也可用剪纸称重法和数格法等。利用斑点面积法进行定量，仪器设备比较简单，但对层析操作要求较为严格，误差为5% ~ 15%，常作为半定量分析方法；洗脱测定法是目前较常用的定量测定法，该方法是先将被测组分的斑点位置确定，将斑点取下，用溶剂将被测组分洗脱下来，收集洗脱液并用适当的方法，如紫外吸光光度法、比色法、电化学方法等进行检测。洗脱测定法虽然操作步骤较多，但只要仔细操作，结果还是比较准确的，因此在没有薄层扫描仪的实验室，用洗脱测定法还是可以解决定量问题的；薄层扫描法用于定量的薄层色谱仪称为薄层色谱扫描仪，用这种仪器对薄层上被分离的

物质进行直接定量的方法称为薄层扫描法。即以一定波长和一定强度的光束扫描分离后的各个斑点，用仪器测量通过斑点或被斑点反射的光束强度的变化以达到定量的目的。测量方式可分为透射光测定法、反射光测定法以及透射光和反射光同时测定法。扫描所用光线可分为可见光、紫外光及荧光三种。定量方法可用外标法、内标法和归一化法。薄层扫描法定量简单快速，斑点吸收峰的描绘和吸光度的积分值可自动记录，每小时可完成60 个试样的测定， 一般测定一个试样只需几分钟，而且测定的灵敏度和准确度都较高, 检出灵敏度为10-6~ 10-9g, 误差约为±3%。

2.6.2 薄层色谱在定量分析中得应用

薄层色谱由于对被分离物质的性质没有限制，可同时进行多个样品的分离， 并可重复测定，可以扫描或彩色摄影永久保存；又由于吸附剂的高效化、定量分析的仪器化和自动化，提高了薄层色谱的分辨率及重现性，因此气相色谱和高效液相色谱并不能完全代替薄层色谱，在实际工作中薄层色谱仍是被广泛应用的一种方法。

3 薄层色谱新技术及其应用

薄层色谱法(TLC) 是较早应用于中药快速分离和定性分析少量物料的一种非常重要的技术。由于其操作简便、色谱结果直观、显色方法可选性大， 兼具分离鉴定双重功能， 还可作为HPLC选择色谱体系， 预测分离的先导技术。而涉及的设备价格低廉，故应用较为广泛。但TLC亦有其缺陷，其色谱结果易受铺板质量、点样技术、展开剂配制、层析环境中展开剂的饱和度、环境温湿度等因素的影响，有时难于重复；显色又受均匀性、灵敏度、稳定性等影响，这均使测定结果偏差较大。最近几年围绕着测定过程的标准化和自动化，薄层色谱技术有了全新的发展，扩大了TLC技术在中药药物定性定量分析中的应用

[14]。

3.1 高效薄层色谱（HPTLC）

HPTLC的薄板是由较细颗粒的吸附剂用喷雾法制成的。点样采用新的装置， 可以自动或半自动完成， 在同一块板上点样数增加。展开方式除了同普通TLC一样的直线展开外，还可采用圆心式展开和向心式展开。由于改进了点样

技术, 板技术, 提高了检测灵敏度，HPTLC的分离能力大大提高，比普通TLC提高3倍。同时又保存了TLC在敞开式床上进行分离的优点，可逐步展开，同步检测，并不存在中毒问题。用HPTLC不仅可以定性，还可用于定量分析。对生物体内药物分析，抗菌素发酵成分分析，药物制剂分析及植物药中有效成分的分析有独特的优势[15]。

TLC常用于分析测定生物碱、黄酮类物质。HPTLC法对这类物质的分离效果更好，且扩大了物质分析的空间。最近几年, HPTLC法用于中药药物的分析报导数量大大增加。杨小明等用反相高效薄层色谱：从银杏叶的石油醚提取物中分离获得了纯度较高的聚戊烯醇同系物的混台物；张尊听等以高效薄层色谱扫描法测定野葛根中游离葛根索及总葛根索含量；伍庆用高效薄层色谱法建立了快速测定知母药材中菝葜皂苷元的方法；米莉莉等用高效薄层色谱扫描法对天然虫草与人工虫草菌丝体中核苷类有效成分进行含量测定，同时建立了不同虫草样品的荧光淬灭薄层色谱指纹图谱； 梁小洁等用高效薄层色谱法建立仙方玉容膏中黄芪甲苷含量的测定方法；梁乾德等综合运用高效薄层色谱(HPTLC)、高效液相色谱 (HPLC) 、电喷雾离子化质谱(ESI- MS) 3种方法对四物汤的cl，c2，c3部位及四味单药相应部位进行分析和比较； 库尔班江等用硅胶G254高效薄层色谱法双波长法对葛根中的有效成分葛根素；对玉泉丸中葛根素和大豆苷元的含量进行了同时测定；对葛根芩连胶囊中葛根素和大豆苷元的含量进行了同时测定； 对心可舒片中葛根索的含量进行了测定；对不同厂家正青风痛宁片中青藤碱 (Sinomenine) 的含量进行了测定；对冠心通脉灵片中葛根素和大豆苷元的含量进行了测定。

这些不同实验结果均显示用HPTLC法测定中药药物中的成分， 斑点与上下斑点距离较远， 清晰， 圆整，无托尾，稳定性和重现性好，板间误差小，分离效率高，快速方便，可以作为中药质量控制和含量测定的依据和分析方法。

3.2假相薄层色谱

假相TLC所使用的的流动相不是有机溶剂，而是低浓度的表面活性剂及环糊精的水溶液，固定剂一般为聚酰胺薄膜。其中以表面活性剂和其他溶剂组成的束胶溶液，以其选择性溶解力，梯度洗脱光学检测方面的独到之处，以及流动相的简单、无毒、不燃烧、价格低廉、处理方便，引起了人们普遍的兴趣。

假相TLC能使一些不溶于水的物质及芳烃异构体得到较好的分离，还可用于药物中微量杂质的限量检查及体内药物分析[16] 。

以聚酰胺为固定剂，表面活性剂的胶束溶液为流动相的假相薄层色谱技术已成功的应用于中药药物的分离鉴定。林辉概等分别以不同浓度的表面活性剂SDS，SDBS，TrionX – 100，OP，Tween – 80，TPC，CTAB，CPC，Zeph的胶束溶液和TrionX - 100与SDS，SD2BS，TPC，CTAB等混合胶束溶液为展开剂，研究了槲皮素、桑色素和芦丁的胶束薄层色谱行为，拟出了以4% Zeph-乙酰丙酮-水( 5:1. 5:5)溶液为流动相，聚酰胺为固定剂的三种黄酮的分离体系, 并对槐花试样中的黄酮进行分离和鉴定, 得到了良好的效果。杜林等分别用CTAT ( 溴化十六烷基三甲铵) 和SDS ( 十二烷基硫酸钠)作展开剂对苦参散中各个组分进行了分离鉴定，发现在一定的溶液浓度下, 两种表面活性剂的胶束溶液都可以分离出单体成分，且CTAT 胶束溶液展开效果优于SDS胶束溶液。戈早川等以2% CPC- 醋酸乙酯( 9:1)胶束溶液为展开剂，在聚酰胺薄膜上成功的分离了黄连及其制剂种的小檗碱、巴马汀和药根碱，并建立了同时测定四种成分的胶束薄层扫描法。梁淑芳等以十二烷基硫酸钠( SDS)-正庚烷-正丁醇-水微乳液作为展开剂，通过聚酰胺薄层色谱，考察了微乳液类型对沙棘黄酮分辨率的影响，结果显示含水量70% 的微乳液作为展开剂，检测灵敏度显著提高，分辨效果理想，为沙棘黄酮的简便正确分离建立了新型的色谱方法。

3.3 反相薄层色谱( RPTLC)

在薄层色谱中，当流动相的极性大于固定相的极性时，就形成反相TLC，一般反相TLC的固定相是化学键合相，虽然制备稍复杂，但其斑点扩散小，广泛用于多种药品的分离，特别适合于组分复杂的混合物的分离。化学键合相硅胶的硅烷化程度也可为分离提供选择性。可根据样品性质选择适当固定相材料，实现最佳分离效果。RPTCL 主要用于极性成分复杂的样品，又可用来考察摸索HPLC的分离条件。

对于含有极性成分的中药的分析鉴定，RPTCL法无疑具有相当的优势。张子忠等以甲基键合硅胶CF254板，甲醇: 水(7:3)为展开剂，对北沙参的成分进行测定，测出了8个主要谱峰，并对欧前胡素成分进行了定性，同时测定了色谱参数，结果表明RPTCL法能简便、快速、高效的分离北沙参中的欧前胡素，该板

性能良好；用BC18F254板，乙腈2水(1B1)作展开剂，展开8 cm 反相薄层色谱扫描法分离并检测蟾酥中的8个成分，其中脂蟾毒配基的定性、定量方法已被建立。并用此法测定了3个蟾酥样品中脂蟾毒配基的含量，平均回收率为103. 8%，变异系数(CV)小于2，比现有其它方法重视性好，分离效率高，操作简便；对不同产地、不同时间采收的蔓荆于中牡荆素和对羟基苯甲酸进行了反相薄层色谱定量分析比较考察了多种因素对分析的影响，同时优化了实验条件，用于蔓荆于中上述两成分的分析，简便重现牲好平均回收率分别为93. 9%，91. 2%。

3.4 薄层扫描法[17]

薄层扫描法( TLC Scanning method) 亦称薄层光密度法( TLC Densitometr y) 。它是薄层色谱技术与光密度计和微型电子计算机结合起来的一种新型仪器分析方法。应用薄层扫描仪 ( 或称薄层光密度计) 可同时对各种复杂的样品进行分离和测定。鉴于其简便快速、灵敏准确、专属性好，因此在生命科学中得到广泛的应用。现已被国内外药典所采用。

薄层色谱法在各国已公认为法定方法，但作为定量测定的薄层扫描法，虽然早在50 年代初就已进行研究，但进展较慢。直至70 年代后应用了Kubelka-Munk 理论推导出反射吸收度与浓度的函数关系才得以成功地解决。虽然当浓度增加至一定程度时不成线性，且与薄层板的性质有关，但是随着电子计算机发展与应用，在薄层光密度计内装有线性化器，由微型电子计算机的程序控制，通过0～1 吸收度单位之间曲线上的7 个点进行校正，使Kubelk 理论曲线中的非线性化数据转变为线性值，使之符合Beer’s 定律，即可定量测定。

蛋白质多肽的基本组成为氨基酸，在临床医学中占有重要位置。林敏等用CS-930 薄层扫描仪测定了人血丙种球蛋白的纯度，作者在醋酸纤维膜上点样2μL (γ-球蛋白120μg) ，经电泳染色后洗净滤膜并用滤纸吸干，选用波长595nm 进行测定。按归一化计算纯度，结果为97. 0% ～97. 8%，平均回收率为100. 7% ( n= 5) 。Nor folk 等用高效薄层色谱( HPTLC) 硅胶板、纤维素板、C-18 键合硅胶板分离了血淋巴液中的18 种氨基酸，并用薄层扫描光密度计测定了其中的丙氨酸和天冬氨酸。Dehtiar等定量测定了发酵肉汤中赖氨酸、苏氨酸、丝氨酸和钴氨酸( VitB12)；Das 等用薄层扫描法测定了从甘蔗中提取的蛋白质氨基酸，

实验将样品水解后，用dansyl:Cl 衍生化，采用硅胶HPTLC 板点样后，以5%EDT A-乙醇-二乙醚( 5: 10: 35)流动相展开后测定。

左旋咪唑是抗癌药之一王建华等用薄层扫描法测定72 例鼻咽癌患者尿中左旋咪唑的含量。实验采用碱性硅胶GF254板，流动相为氯仿-甲苯-丙酮( 7: 5:

2) 。尿样经碱化用乙酸乙酯提取，浓缩后点样。用CS-930 薄层扫描仪以盐酸普鲁卡因为内标，在波长236nm 处测定，其线性范围在5～200nmol·L-1。平均回收率：96. 9% ( n= 5) ，最低检出浓度：3. 05nmol·ml -1，尿样检出浓度: 58.1nmol·ml-1，为指导临床用药提供了参考。

4 总结

传统TLC技术由于精密度和重现性均较差，曾一度被其他快速发展起来的分离分析技术所取代，然而20 世纪80年代以来，随着薄层在色谱板、点样技术、展开技术方面的发展，薄层色谱的规范化和仪器化程度大大提高。加之直观、经济、简便的特点，将在中药多样品的分析中发挥更大的作用。

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