巨噬细胞吞噬实验&沉淀实验实验报告

实验二

一巨噬细胞吞噬功能实验

【原理】巨噬细胞是单核吞噬细胞系统的主要细胞，局域活跃的吞噬功能。吞噬细胞受抗原刺激后活化，可使吞噬功能明显增强。

在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠腹腔注射鸡血红细胞，30min后处死小鼠，取出腹腔液，以冷亚甲蓝染色，显微镜下计数吞噬红细胞的百分数，及观察吞噬细胞内鸡红细胞的数目，以判断吞噬细胞的杀伤能力，由此间接地测定机体的非特异性免疫水平。

【方法】体内法：

（1）实验前3小时，小鼠腹腔注射6%无菌淀粉液1ml，诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。

（2）实验时，每只小鼠注射鸡红细胞1ml，轻柔腹部，使其在腹腔中分布均匀，利于吞噬。

（3）30min后，将小鼠拉颈处死，固定，打开腹腔暴露肠管，用载玻片轻擦腹腔，使腹腔液均匀涂于载玻片过，再滴一滴0.03%冷亚甲蓝溶液，盖上盖玻片。

（4）高倍镜下进行观察，计数。

【结果】

【分析】

在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠注射鸡红细胞后镜检腹腔液，可观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，并且可看到部分鸡红细胞聚集到吞噬细胞附近。

二沉淀反应双向琼脂扩散实验

【原理】将可溶性抗原与相应抗体分别加入琼脂板上的孔内，二者均可发生扩散，并且随扩散距离的增大浓度降低，在抗原抗体比例适宜处形成可见的沉淀线。本实验是定性实验，常用于分析抗原抗体的纯度关系以及相互关系。

【方法】

（1）制板：将熔化的1%琼脂加在载玻片上约5ml

（2）打孔：待琼脂凝固后，将载玻片置于打孔样板上，用打孔器打孔

（3）加样：在中央孔内加抗体，上下两孔加抗原1，左右加抗原二，每孔加10μl

（4）结果观察：将琼脂板置于湿盒，37℃一天后观察结果。

【结果】

在中央孔与添加抗原1的孔之间出现沉淀线，有抗原抗体反应，为阳性反应，说明抗原1与抗体相对应。中央孔与添加抗原2的孔之间没有沉淀线，说明抗原2与抗体之间不相对应。

【分析】抗体与抗原发生扩散时，随扩散距离的增大浓度降低，在抗原抗体比例适宜处形成可见的沉淀线。当有沉淀线出现时，说明有抗原抗体反应。

琼脂铺板时要一次铺成，并且铺设均匀。

打孔时要注意垂直打孔，注意不要有裂隙产生。

第二篇：实验报告20xx.9

胸腺五肽缓释微囊的制备及释放性能研究

一综述

1.1引言

本实验目的研究以壳聚糖和海藻酸钠为基质材料，制备胸腺五肽缓释微囊。采用方法以微囊的药物包封率为制备工艺优化指标，利用复凝聚法，通过正交试验得出微囊的最佳制备工艺条件。

实验结果：微囊形态及稳定性较好，有良好的缓释效果

1.2胸腺五肽介绍

1.2.1胸腺五肽

胸腺分泌物的一种胸腺生成素Ⅱ的有效部分。胸腺生成素Ⅱ是从胸腺激素中分离出来的单一多肽化合物，由49个氨基酸组成，而其中由5个氨基酸组成的肽链片段，却有着与胸腺生成素II相同的全部生理功能，所以就把这个五肽片段称为胸腺五肽。

1.2.2胸腺五肽的理化性质

胸腺五肽由精氨酸、赖氨酸、天门冬氨酸、缬氨酸、酪氨酸五种氨基酸组成。其化学名称为 N-〔N-〔N-〔NL-精氨酰-L-赖氨酰〕-L-α-天冬氨酰〕-L-缬氨酰〕-L-酪氨酸。分子式：C30H49N9O9 。分子量：679.77。

胸腺五肽是一多肽小分子蛋白质类药物，是用多肽固相合成法制备的，以特定的氨基酸组成的单一化学物质，只有确定的分子式及分子量，由两个碱性氨基酸、两个中性氨基酸及一个酸性氨基酸组成，故胸腺五肽成微碱性，溶于水及乙酸，不溶于乙醛及乙酸乙酯等有机溶剂。通常用高效液相色谱法测定其含量，用紫外光谱，氨基酸组分分析和质谱确定其结构。

对于固相法合成所得的多肽，其结构的确证方法与合成方法所得到的有机化合物化学结构的确证方法不完全相同。国内和国际通常只采用紫外光谱，氨基酸组分分析和质谱，并不必须用红外光谱，核磁共振及氨基酸序列分析。

1.2.3胸腺五肽的作用及机理

　胸腺五肽的作用之一是诱导T细胞分化。它可选择性地诱导Thy-1-的前胸腺细胞转化为Thy-1+的T细胞。其T细胞分化作用由胞内cAMP水平升高介导。胸腺五肽的另一基本作用是对成熟外周血T细胞的特异受体结合，使胞内cAMP水平上升，从而诱发一系列胞内反应，这也是它免疫调节功能的基础。在正常机体状态下胸腺五肽显现免疫刺激作用，能显著增高脾淋巴细胞的E玫瑰花结形成率及转化率，对免疫应答的初次或再次反应的不同阶段都有增强作用，能增多IgM类型和IgG或IgA类型的抗体形成细胞。胸腺五肽还可增强巨噬细胞的吞噬功能，增加多形核嗜中性白细胞的酶和吞噬功能，升高循环抗体含量，增强红细胞免疫功能。胸腺五肽能活化CD4和CD8阳性细胞，使专一的Tc细胞寿命维持更长时间，同时也可活化Th细胞，诱导Ts细胞的功能。胸腺五肽的抗感染力和治疗作用与它增进TC细胞活性相关。在抗感染免疫中适量胸腺五肽可明显增加干扰素的产生。诱导和促进T细胞分化成熟；调节T淋巴细胞亚群比例使CD4/CD8趋于正常；增强巨噬细胞吞噬功能；增强红细胞免疫功能；提高自然杀伤细胞的活力；提高白介素-2的产生水平与受体表达水平；增强外周血单核细胞γ干扰素的产生；增强血清中SOD活性。

　　可用于恶性肿瘤病人经放化疗后，免疫功能损伤者；乙型肝炎的治疗；重大外科手术及严重感染；自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎，红斑狼疮；Ⅱ型糖尿病、更年期综合征；年老体衰免疫功能低下者。

1.3微囊

1.3.1微囊的基本概念和发展前景

微囊系利用天然的或合成的高分子材料（统称为囊材）作为囊膜壁壳，将固态或液态药物包裹成为的药库型微型胶囊。微囊可以掩盖药物的不良气味及口味；还能够提高药物的稳定性；并会减少药物对胃的刺激；固化液态药物，以方便其使用；减少复方药物的配伍变化；应用最多的是通过微囊化方法形成缓控释制剂和靶向制剂；一些微囊还可以将活细胞或者生物活性物质包裹在内。

　微囊的囊材要有无毒无刺激、化学性质稳定、具有适宜的释药性、有一定的强度、有合格的粘度等特性，常用的囊材主要有天然高分子囊材，如明胶、阿拉伯胶、琼脂、海藻酸及其盐、壳聚糖等；半合成高分子囊材，如羧甲基纤维素钠、醋酸纤维素碳酸酯、乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素；合成高分子囊材包括生物降解的聚碳酯、聚氨基酸、聚乳糖、丙交酯乙交酯共聚物、聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物，非生物降解的聚酰胺、硅橡胶等。

制备微囊的过程称为微囊化，常用的微囊化方法有物理化学方法、物理机械方法、化学法。

微囊技术发展至今，在许多领域中已经显示出优越的性能，并得到广大研究者的重视，但其适用度却不高。尤其在我国，微囊产品同潜在市场相比，仅仅是一小部分，今后此技术将在我国得到广泛的应用。

1.3.2微囊的功能

1 粉末化将不易加工贮存的气体、液体原料固体化,从而提高其溶解性、流动性和贮藏稳定性,如粉末香精、粉末食用油脂、粉末乙醇等。例如:将液体油脂作为心材,选择适当的壁材,运用微胶囊技术就可产生出固体粉末油脂,非常方便地添加于各种食品原料中。有报导说,在国外,目前约有数十种微胶囊产品的粉末油脂作为食品工业原料,应用于各类营养保健食品或功能型食品。

2 降低挥发性防止风味成分的挥发,减少风味损失。

3 降低毒性　减少食品添加剂的毒理作用等，如硫酸亚铁阿司匹林等药物包裹后，可通过控制释放速度来减轻对肠胃副作用。对于制药工业来说，可采用微胶囊技术制造靶制剂，达到定向释放效果。

4 提高物质的稳定性(易氧化，易见光分解，易受温度或水分影响的物质) 许多食品添加剂制成微胶囊产品后,由于有壁材的保护,能够防止其氧化,避免或降低紫外线、温度和湿度等方面的影响,确保营养成分不损失,特殊功能不丧失。

5 能使不相容成分均匀地混合运用微胶囊技术,将可能相互反应的组分分别制成微胶囊产品,使它们稳定在一个物系中,各种有效成份有序地释放,分别在相应时刻发生作用,以提高和增进食品产品的风味和营养。例如:有些粉状食品对酸味剂十分敏感。因为酸味剂吸潮会引起产品结块;并且酸味剂所在部位pH 值变化很大,导致周围色泽变化,使整包产品外观不雅。将酸味剂微胶囊化以后,可延缓对敏感成分的接触和延长食品保存期限

6 掩味某些营养物质具有令人不愉快的气味或滋味,这些味道可以用微胶囊技术加以掩蔽。这种微胶囊产品在口腔里不溶化,而在消化道中才溶解,释放出内容物,发挥营养作用

7 隔离活性成分能保持食品中微量营养素和生理活性物质对人体的活性作用

8 控制心材释放和作用的时间和数量微胶囊产品经由预先设计的溶解和释放的机理,可提供特殊的释放方式。

1.4囊材的介绍

1.4.1壳聚糖的介绍

甲壳素(Chitin)作为一种纯天然可再生的自然资源，在自

然界中是含量仅次于纤维素的第二大天然多糖类，具有良好的

生物相容性、生物可降解性、抗菌等优异生物特性，由甲壳素

脱乙酰制备的含有游离氨基的壳聚糖是壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖,是甲壳素线性多聚物基本组成单位β - (1, 4) - N - 乙酰基葡萄，作为药物缓释载体具有无毒无刺激良好的生物相容性、生物黏附性、低毒性、易降解吸收，消炎、抗菌、止血、抑制癌细胞转移，组织相容性好，体内安全性高等特点。其带正电性和良好的生物黏附性使其在黏膜表面负电荷条件下黏附性增加，药物滞留时间延长，且壳聚糖分子内具有活性基团NH2，可与含双官能团的醛或酸酐药物化学偶联，使药物大量分布于偶联结构内缓慢释放，因此用壳聚糖制备的微球作为药物载体明显优于一般材料，近年来受到有关研究者的广泛关注。

1.4.2海藻酸钠的介绍

海藻酸钠(C6H7O8Na)n主要由海藻酸的钠盐组成，由a-L-甘露糖醛酸(M单元)与b-D-古罗糖醛酸(G单元)依靠1,4-糖苷键连接并由不同比例的GM、MM和GG片段组成的共聚物

　海藻酸钠又名褐藻酸钠、海带胶、褐藻胶、藻酸盐，是由海带中提取的天然多糖碳水化合物。广泛应用于食品、医药、纺织、印染、造纸、日用化工等产品，作为增稠剂、乳化剂、稳定剂、粘合剂、上浆剂等使用。自八十年代以来，褐藻酸钠在食品应用方面得到新的拓展。褐藻酸钠不仅是一种安全的食品添加剂，而且可作为仿生食品或疗效食品的基材，由于它实际上是一种天然纤维素，可减缓脂肪糖和胆盐的吸收，具有降低血清胆固醇、血中甘油三酯和血糖的作用，可预防高血压、糖尿病、肥胖症等现代病。它在肠道中能抑制有害金属如锶、镉、铅等在体内的积累，正是因为褐藻酸钠这些重要作用，在国内外已日益被人们所重视。日本人把富含有褐藻酸钠的食品称为“长寿食品”，美国人则称其为“奇妙的食品添加剂”。

螯合剂对海藻酸钠溶液性质的影响螯合剂可以络合体系中的二价离子，使得海藻酸钠能稳定于体系中。

作为饮料/乳品等的增稠剂海藻酸钠在增稠方面有独特的优势：海藻酸钠良好的流动性，使得添加后的饮品口感柔滑；并且可以防止产品消毒过程中的黏度下降现象。在利用海藻酸钠作为增稠剂时，应尽量使用分子量较大的产品，适量添加Ca。。可以大大提高海藻酸钠的黏度。

作为冰淇淋等冷饮的稳定剂海藻酸钠是一种高档的稳定剂，它可使冰淇淋等冷饮食品产生平滑的外观、柔滑的口感。由于海藻酸钙可形成稳定热不可逆凝胶，因而在运输、储藏过程中不会变粗糙(冰晶生长)，不会发生由于温度波动而引起的冰淇淋变形现象；同时这种冰淇淋食用时无异味，既提高了膨胀率又提高了融点，使得产品的质量和效益都有显著提高。产品口感柔滑、细腻、口味良好。添加量较低，一般为1—3‰，国外添加量为5—10‰。

作为乳制品及饮料的稳定剂用海藻酸钠稳定的冰冻牛乳具有良好的口感，无粘感和僵硬感，在搅拌时有粘性，并有迟滞感。

1.5 微囊的制备方法

1.5.1相分离-凝聚法

1.6.3微囊的载药量和包封率

（1）微囊载药量的测定微囊中药物的含量用载药量来表示，微囊的载药量是指单位重量微囊中所含药物的量，用下式表示：

（2）微囊包埋率的测定

对于微囊制剂，特别是液体剂型成品。涉及微囊中药物量和介质中游离药物的比例问题。因为微囊分散于液体介质中，必然会有药物从中释入介质，经一定时间后微囊中药物与介质中药物达成动态平衡，微囊中药物量与体系中药物总量（微囊中药物与介质中药物之和）之比，成为微囊制剂的药物包封率。其中，单位体积或重量微囊制剂中被载上微囊的药物量与体系中药物总量之比用下式表示：

收率=×100%

二.实验部分

2.1实验药品及仪器

2.1.1药品

壳聚糖、海藻酸钠、胸腺五肽、戊二醛、司班80、液体石蜡、乙醚、醋酸、生理盐水、氢氧化钠。

2.1.2仪器

电子天平、紫外分光光度计、磁力搅拌器、溶出度测定仪、超声波细胞粉碎机、真空干燥器。

2.2实验方法

2.2.1复凝聚法制备微囊

试剂浓度量见表1

150ml烧杯中加入海藻酸钠固体，用30ml蒸馏水溶解（溶解时，先加10ml，大部分溶解以后再将蒸馏水全部加入），用磁力搅拌机搅拌一小时，配置成均一的胶状溶液，加入也液体石蜡30ml及0.15ml（1滴）Span-80，继续搅拌30min，形成水/油型乳液。另取与海藻酸钠等量的相对分子质量500000的壳聚糖以2%HAc溶解（用量筒准确称取19.5ml醋酸，用玻璃板转移到1000ml容量瓶中，用蒸馏水洗涤量筒2-3次，洗涤液转移到容量瓶中，加蒸馏水定容。），加入CaCl2 1.0g及0.1g胸腺五肽,配制得含药壳聚糖溶液40ml，搅拌下逐滴加入到上述水/油型乳液中，控制滴速16ml/h(约1d/10s)。滴完后，用NaOH（称取5g氢氧化钠在烧杯中用50ml蒸馏水溶解）调节pH值至正交试验表要求值，继续搅拌90min，待液体温度<10摄氏度，加入交联剂戊二醛固化120min，充分振摇后防止30min,离心（3000r/min）分出沉淀物，用蒸馏水、乙醚分别反复洗涤后，即得胸腺五肽壳聚糖-海藻酸钠载药微囊。将所得产品于35摄氏度真空干燥24h.

表1 正交试验因素水平表

A：壳聚糖浓度(mg/ml)；B：成球过程反应温度(C)；C：PH值；D:戊二醛用量（ml）

2.2.2微囊包封率及载药量测定

将微囊在瓷研钵中研磨后精取适量，在0.9%生理盐水（取氯化钠9.0817克在小烧杯中溶解，待全部溶解后，用玻璃棒移到1000ml容量瓶中，再用蒸馏水洗涤烧杯两到三次，洗涤液全部转移到容量瓶中，加蒸馏水到容量瓶的刻度线。）精确称取10mg微球，放入50ml容量瓶中，加生理盐水缓冲溶液，直到25-35ml。超声波震荡使微囊破裂释放药物，用生理盐水缓冲溶液定容50ml，用微孔滤膜过虑后，用生理盐水缓冲溶液为参比溶液，在波长280nm下测定吸光度A,用上述标准曲线求浓度，按下式计算包封率和载药量。

包封率=（微囊中胸腺五肽含量/初始投药量）*100%