生物化学实验预习报告

实验六 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量

一、研究背景

电泳技术的发明是人们在分离纯化技术中的“差异转换”思路上一次伟大的飞跃，在实际应用的过程中，人们发现了它在大量样品纯化上的劣势以及分析上的突出优点，进行“扬长避短”，最终将其作为生物大分子分离鉴定的常用技术而被保留与发展下来。自电泳技术发明以来，生命科学领域迅猛发展，人们对生物大分子的研究不能仅仅停留在分离、纯化、鉴定这些宏观操作上，需要确定它们的分子量进行更加深入的研究，所以迫切需要一种新技术能够测定像蛋白质这样的生物大分子的相对分子质量。人们又把目光转移到迅猛发展的电泳技术上来，试着去寻找突破口。在之前的非变性电泳技术中，生物大分子得以分离的基础是基于三方面的差异，即分子质量、分子大小与形状、电荷性质。如果要测定种生物大分子的分子质量，直接测定难度很大，这就需要首先找到一个参照标准（标准蛋白），在待测蛋白与标准蛋白之间进行“差异缩小”，将他们在电场中泳动速度的大小仅仅体现为分子量上的差异，再通过寻求某种线性关系就能得到蛋白质样品的分子质量。此外，人为地借助其他物质处理来缩小这些差异也就意味着破坏蛋白质的原有结构，变性电泳便成了必然。这一步是整个技术的核心，也是最难的突破的。1967年，Shapiro年首次报告了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统，根据他对11种蛋白质电泳获得的结果，发现蛋白质（或亚基）分子量的对数与蛋白质分子的迁移率之间有直线关系。随后，Weber等人进行深入研究，肯定了Shapiro的发现，确立了以连续的磷酸盐系统作为电极缓冲系统的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量的新方法。后来，Laemmli将SDS电泳和Davis的不连续盘状电泳结合起来，设计出了不连续的SDS-Tris-甘氨酸系统。^[1]由于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、重复性好、微量、设备简单、价廉和操作容易、迅速等优点，因而得到了迅速的发展和广泛的应用，目前已成为蛋白质研究的有力工具，广泛地应用于分子生物学、生物化学、遗传学、病理学、微生物学和植物生理学等学科的研究中。

在本次实验中，我们采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Tris-甘氨酸系统）测定蛋白质分子量，体会学习这一技术的发明历程、原理及操作。

二、研究目标

1.体会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的发明历程；

2.进一步学习和掌握垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理与方法；

3.学习和应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量。

三、研究策略

1.同时对蛋白质样品和标准蛋白进行处理，消除他们在形状以及电荷量上的差异，仅剩下分子量的差异；

2.将处理后的样品和标准蛋白在相同条件下进行电泳，他们的迁移速度不同，经过一段时间后，会体现出迁移距离上的差异。

3.分析相对迁移率和蛋白质分子质量之间的关系，作出图像，计算样品蛋白的相对迁移率，从图像上直接得出它的分子质量。

四、研究方案及可行性分析

1.研究方案

SDS（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate）是一种很强的阴离子表面活性剂，它以其疏水基和蛋白质分子的疏水区相结合，形成牢固的带负电荷的SDS-蛋白质复合物。SDS和蛋白质的结合是高密度的，其重量比通常为1.4 : 1，由于这种高密度的结合，新引入的净电荷远远超过蛋白质分子原有的净电荷，从而消除或极大地降低了不同蛋白质分子之间原有净电荷的差异，即消除了由于各种蛋白质所带净电荷的不同对电泳迁移率的影响。

SDS-蛋白质复合物具有均一的电荷密度、相同的荷质比。据流体力学等方面的研究推测，SDS-蛋白质复合物呈紧密的椭圆形或棒状结构，棒的短轴是恒定的，在18A的数量级，与蛋白质的种类无关；棒的长轴是变化的，而且与蛋白质的分子量成正比。这就是说，SDS和蛋白质结合后所形成的SDS-蛋白质复合物，消除了由于天然蛋白质分子形状的不同对电泳迁移率的影响。

带电分子电泳迁移率的大小取决于三个方面，即带电荷的多少、分子量的大小和分子的形状。根据上面的分析，SDS作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS和蛋白质结合后使其电泳迁移率仅取决于蛋白质分子量的大小，因而可以通过比较未知分子量的蛋白质和已知分子量的蛋白质分子的迁移率，测定出未知蛋白质的分子量。

2.可行性分析

从基本的实验原理、到研究方案和具体操作，再考虑实验器材和时间等因素，本实验均有较大的可行性。在具体操作中需要注意以下问题：

（1）SDS处理样品之后保证蛋白质的迁移率仅取决于分子量大小。操作时，首先应保证SDS单体的浓度，当单体浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4，才能消除电荷的差异。还要注意加入还原剂如巯基乙醇，充分断开二硫键，在SDS和还原剂共同作用下，使蛋白质解聚成多肽链，随后与SDS充分结合，消除结构（形状）差异。

（2）电泳操作中一系列条件的控制。此处不再赘述。

五、具体实验设计

1.实验仪器及试剂

仪器：垂直板电泳槽及附件、直流稳压电源（600V，100mA）、10mL注射器1支；微量进样器（100μl×1）；

器具：微量可调手动移液器；

试剂：三羟甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙烯酰胺（Bis）、十二烷基硫酸钠（SDS）、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵、甘油、巯基乙醇、溴酚蓝、考马斯亮蓝R-250、甘氨酸、盐酸、乙酸、冰醋酸；

材料：实验四麦清蛋白脱盐样品。

2.实验步骤^[2]

（1）电泳槽的安装（10min）

洗液浸泡玻璃板→热水、馏水冲洗→干燥，装入硅胶夹套，垂直固定于两半槽之间（对角线螺旋依次拧紧）→高玻板一侧注入2%的琼脂（防漏胶）

（2）制胶（30min）

A. 按照下表所示配制分离胶（T%=12.5%）

小烧杯中混匀立即灌胶（电泳槽微倾）→灌至距短玻璃片顶端2cm→放平电泳槽，立即用滴管覆盖水层→界面二次出现时，静置将水倒出（余下的水用滤纸片吸干）

B. 按照下表配制浓缩胶

混合均匀后立即灌胶，同分离胶灌至方法，灌至与矮玻板顶端相齐时，立即插入梳子。

C. 向电泳槽内倒入电极缓冲液，短玻璃片一侧没过顶端，长玻璃片没过电极丝。小心拔梳子准备点样

（3）样品的处理（15min）

Marker：市售标准样品按要求处理；

待测样品：麦清蛋白初步提取的凝胶过滤脱盐实验所获峰值管制备的SDS-PAGE样品。

将上述样品均置于沸水浴中加热5min，冷却上样（上样量：Marker 20μl；待测样品梯度上样，4μl、10μl、20μl、30μl、50μl）。

（4）电泳（2.5h）

取稳流状态，浓缩胶15mA，分离胶20mA（注意电压）。特别注意溴酚蓝前沿指示剂不能跑丢。

（5）检测（2.5h）

取胶板置于水中浸泡10min→胶板置于染色液中加热2h（通风橱）→脱色液脱色至条带清楚→观察结果。

（6）测量蛋白质分子的迁移率和未知样品的分子量

将溴酚蓝迁移距离定为d₁，蛋白质迁移距离定为d₂，根据下面公式计算各种蛋白质的迁移率R_m：R_m=

以标准蛋白迁移率为横坐标，对应的分子量为纵坐标，在半对数坐标纸上作图，得到一条直线。根据未知样品的迁移率，在直线上查出对应的分子量，注意纵坐标原点的选择。

3.实验所需时间预计

整个实验预计所用时间约为6h。

六、参考文献

[1] 朱广廉，杨中汉. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量. 植物生理学通讯[J]. 1982，02: 43~47.

[2] 中国农业大学生物学院. 生物化学实验指导[M]. 中国农业大学自编教材. 42~45.

 

第二篇：06 生物化学实验--SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量

SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量

【目 的】

1 ．掌握 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的操作方法。

2 ．熟悉 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原理。

【原 理】

带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。不同蛋白质分子具有不同的大小、形状，在一定的 pH 环境中带有不同的电荷量，因而在一定的电场中所受的电场引力及介质对其的阻力不同，二者的作用结果使不同蛋白质分子在介质中以不同的速率移动，经过一定的时间后得以分离，这就是电泳分离蛋白质及核酸生物大分子的基本原理。聚丙烯酰胺凝胶电泳就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关，为了使其只与蛋白质分子的大小有关，从而利用蛋白质在介质中的迁移率来测定蛋白质的分子量，就需要消除蛋白质分子的形状和所带电荷量的不同对迁移率的影响或减小到可忽略不计的程度。

SDS 是十二烷基硫酸钠（ sAium dAecyl sulfate ）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与 SDS 的结合比为 1.4 g SDS/ 1 g 蛋白质），使各种蛋白质 -SDS 复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。

SDS 与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。 SDS- 蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样（约为 18? ，即 1.8 nm ），而长轴则随蛋白质分子量成正比的变化。说明， SDS 和蛋白质的结合所形成的 SDS- 蛋白质复合物消除了由于天然蛋白质形状不同而对电泳迁移率的影响。

因此，由于 SDS 与蛋白质的结合，消除了蛋白质所带静电荷的多少和分子形状的不同对电泳迁移率的影响，使其迁移率在外界条件固定的情况下，只取决于蛋白质分子量大小一个因素，而且当蛋白质分子量在 15kD ～ 200kD 之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关系，符合下列方程式：

Lg MW ＝ － b m R ＋ k

式中 MW 为蛋白质分子量。 m R 为相对迁移率， k 为截距， b 为斜率。在一定条件下， b 和 k 均为常数。

采用 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量简便、快速、重复性好；所需仪器设备廉价，样品蛋白质微量；在分子量为 15kD ～ 200kD 的范围内所测得的结果与用其他方法测得的分子量相比，误差一般不超过 10% ，所以应用非常广泛。

SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳作为一种单向电泳技术，按照凝胶电泳系统中的缓冲液、 pH 和凝胶孔径的差异可分为 SDS- 连续系统电泳和 SDS- 不连续系统电泳两类；按照所制成的凝胶形状和电泳方式又可分为 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶垂直柱型电泳和 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳两类。它们分别称为：

SDS- 连续系统垂直柱型聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS- 不连续系统垂直柱型聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS- 连续系统垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS- 不连续系统垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳

无论采用哪种，其基本原理都一样，具体操作也大同小异。由于 SDS— 不连续系统具有较强的浓缩效应，因而它的分辨力比 SDS- 连续系统电泳要高一些，所以更为常用。本实验以 SDS- 不连续系统为例进行介绍。

【器 材】

1 ．电泳仪，直流稳压电源，电压 400 ～ 500V ，电流 100mA

2 ．微量加样器

3 ．电泳槽装置

4 ．大号试管和中号试管

5 ． 5ml 注射器和 9 号注射针头

6 ．洗耳球、滤纸条、封口膜等

7 ．大培养皿

【试 剂】

? 标准蛋白质：

根据待测蛋白质分子量的大小，选择 4 ～ 6 种已知分子量（分为低分子量、中分子量和高分子量）的蛋白质纯品作为标准蛋白质。

2 ．电极缓冲液、凝胶缓冲液及凝胶储备液：

SDS- 不连续系统 PAGE 的 电极缓冲液、凝胶缓冲液及凝胶储备液配制见下表：

储液配制好后放冰箱 4 ℃ 冷藏备用，用时 10 倍稀释，学生用时大约 3 天需更换一次。

3 ． 10% 过硫酸铵 (Ap)

1 g 过硫酸铵加 蒸馏 水至 10 ml ， 0.1ml 分装 4 ℃ 保存，保存时间为 1 周。

4 ． TEMED （四甲基乙二胺）溶液： 4 ℃ 保存。

5 ． 10% SDS 溶液

10 g SDS 加 蒸馏 水至 100 ml 。 50 ℃ 水浴下溶解，室温保存。

6 ． Tris-HCl 缓冲液（ 0.05 mol ∕ L ， pH 8.0 ）

称取 0.61 g Tris ，加入 50 ml 蒸馏水中溶解，再加入 3 ml 1 mol ∕ L 的 HCl ，混匀，调 pH 至 8.0 ，加蒸馏水定容至 100 ml 。

7 ． 2 ×样品缓冲液

20% （ W/V ） SDS 2.0 ml ，巯基乙醇 0.1 ml ， 0.1% （ W/V ）溴酚蓝 0.5 ml ，甘油 1.0 ml ， 0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液 （ pH8.0 ） 2.0 ml ，最后定容至 10 ml 。

8 ．固定液

取 50% 甲醇 454 ml ，冰乙酸 46 ml 混匀。

9 ．考马斯亮蓝 R250 染色液

称取考马斯亮蓝 R250 0.125 g ，加上述固定液 250 ml ，过滤后备用。

10 ．脱色液

冰乙酸 75 ml ，甲醇 50 ml ，加蒸馏水定容至 1 000 ml 。

【操 作】

1 ．安装电泳槽

（ 1 ）将玻璃板用蒸馏水洗净晾干，准备 2 个干净的小烧杯。

（ 2 ）将玻璃板在灌胶支架上固定好。固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。

2 ．制备 分离胶和浓缩胶

分离胶和浓缩胶的配制见下表：

一旦加入 Ap ，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。

根据上表先配制分离胶至锥形瓶中，用移液器沿着玻璃板壁缓缓加入，加入过程中防止气泡的产生，加至距离低位置玻璃板顶端 3 cm 处，之后立即覆盖一层蒸馏水，静置 40 min ，待分离胶与水层之间形成清晰的界面时表明胶已经凝聚好。待聚合完成，倒掉覆盖层，用去离子水清晰凝胶顶部数次以去处残留的未聚合的丙烯酰胺，倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干。

然后，按上表 再 制备好浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘 5 mm 处，迅速插入样梳，静置 40 min 。待浓缩胶聚合后，加入电极缓冲液，拔去梳子。

3 ．样品的制备：

（ 1 ）标准蛋白样品的制备：取标准蛋白（ 575μg/ 瓶），开封后，溶于 100 μl 双蒸水，分装于 20 个小瓶内（每管 10 μl ），再于每个小管内加入等体积的 2 ×样品缓冲液（ 10 μl ），置 － 20 ℃ 保存，使用前置室温融化后， 于沸水浴中加热 3 ～ 5 min 后上样。

（ 2 ）待测蛋白样品的制备：若样品是水溶液且浓度大于 10 mg/ml ，可将待测液与样品缓冲液等体积混匀，然后同上加热。固体样品制备与标准蛋白相同。

4 ．加样：

电泳槽中加入电极缓冲液，每孔加入 20 μl 样品。

5 ．电泳：

接通电源，进行电泳，开始电流恒定在 10 mA ，当进入分离胶后改为 20 mA ，溴酚蓝距凝胶边缘约 5 mm 时，停止电泳。

6 ．固定与染色：

电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入固定液，轻轻振摇 20 h ，倒掉固定液。倒入染色液染色至少 4 h 。

7 ．脱色：

染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。期间更换脱色液 2 ～ 3 次。

8 ．计算分子量：

（ 1 ）相对迁移率的计算：通常使用相对迁移率（ m R ），计算方法如下：

相对迁移率（ m R ）＝样品迁移距离（ cm ） / 染料迁移距离（ cm ）

（ 2 ）标准曲线制作

以标准蛋白的相对迁移率（ m R ）为横坐标，标准蛋白分子量的对数为纵坐标，在坐标纸上做出标准曲线。

（ 3 ）求未知蛋白样品的分子量。

根据待测样品的相对迁移率直接从标准曲线上查出该蛋白质的分子量。

【注意事项】

1 ．缓冲液的 pH 值，浓度要准确配置，所用的水最好为双蒸水。

2 ．有些试剂要避光保存，有的要新鲜配置。

3 ． SDS ， Acr ， Bis 的试剂要求纯度较高，要求分析纯或进口分装的，如果纯度不够，需要重结晶一次或二次，方可使用。

4 ．待测样品要用低离子强度的样品，如果离子强度过高，需要通过透析或离子交换除盐。

5 ．凝胶配制过程要迅速， 催化剂 TEMED 要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。

6 ．样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平 .

7 ．剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分。

8. 梳子拔出后，加入缓冲液，要使锯齿孔内的气泡全部排出，否则会影响加样效果。

【思考题】

1 ． 该实验中是如何去除不同蛋白质间电荷效应的？

2 ．综合分析影响 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量结果的因素。

3 ．为什么加样前需在沸水中加热样品液？为什么当分离胶加完后，需在其上加一层水？

附：

1 ．一些已知标准蛋白质的分子量，见表 3-4 。

表 3- 4 标准蛋白质的分子量

2 ． 不同浓度 SDS- 不连续系统聚丙烯酰胺凝胶 的配制，见表 3 -5 。

表 3-5 SDS- 不连续系统 不同浓度 聚丙烯酰胺凝胶 的配制