聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

一、目的要求
（1）学习电泳原理和技术
（2）学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质技术

二、实验原理

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12～25个组分。因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。

聚丙烯酰胺凝胶作为电泳材料的特性
人工合成聚丙烯酰胺凝胶的化学体系的组成及功能：
Acr：丙烯酰胺
Bis：甲叉双丙烯酰胺
AP：过硫酸铵——化学催化剂
TEMED：四甲基乙二胺——加速剂

SDS是一种阴离子去垢剂，SO₃^2-带负电荷。在含有强还原剂的SDS溶液中可形成SDS-蛋白质复合物。由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。

三、实验材料

（一）试剂

1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 为29:1） 称取丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，用去离子水溶解并稀释至100ml，贮棕色瓶中于4℃保存，可用一个月。

2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液 取1mol/L HCL溶液48ml、三羟甲基甲烷（Tris）36.6g，加双蒸馏水至80ml使其溶解，调pH至8.8，然后用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。

3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液 取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加双蒸馏水至80ml，调pH6.8，用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。

4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液 称取Tris 6g、甘氨酸28.8g，加蒸馏水850ml，调pH至8.3，加蒸馏水到1000ml，4℃贮存。用时可做10倍稀释。

5、10% 过硫酸铵（AP）

6、10%SDS（十二烷基磺酸钠） 称取SDS 10g，加蒸馏水100ml使其溶解。

7、四甲基乙二胺（TEMED）

8、上样缓冲液 取1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液6.25ml，蔗糖10g，SDS 2.3g，1g/L溴酚蓝10ml，加蒸馏水溶解，混合至100ml。

9、考马斯亮蓝染色试剂 考马斯亮蓝R250染色液：浓度为2.5g/L，用甲醇∶醋酸∶蒸馏水=5∶1∶5的溶液配制（V/V）。

10、脱色液：取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml，加蒸馏水至100ml。

11、样品：人血清。

12、蛋白质分子量标志物 市售中分子量蛋白质分子量标志物。也可选择5种以上的已知分子量蛋白质自行配制，注意其分子量分布要能满足需要，各种蛋白质的浓度基本相等。

（二）仪器 圆盘电泳槽（或垂直板电泳槽）、稳压稳流电泳仪 、脱色摇床。

四、实验方法

（一）准备圆盘电泳槽、电泳仪。

（二）凝胶制备 按下表分别配制分离胶和浓缩胶（此量可供2人用）

            分离胶(12% 5ml)     浓缩胶(5% 2ml)
ddH2O          1.6ml                1.4ml
30%混合液       2.0ml                0.33ml
1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl 1.3ml    1.0mol/L pH6.8 Tris-HCl 0.25ml
10%SDS         50μl                 20μl
10%Ap           50μl                 20μl

TEMED           4μl                  4μl

注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速用滴管灌胶
（三）灌胶

1、先将胶管（5х90mm）封好底，将配制好的分离胶液灌注入胶管内，约70mm高度（掌握分离胶的高度），在凝胶表面轻轻加一层正丁醇液（约3～4mm）。用于隔绝空气，使胶面平整。室温下静置约30～60min。观察胶和正丁醇之间的界面，判断胶是否凝固。要在确认分离胶彻底凝固后才开始配制浓缩胶。

2、分离胶凝固好后，倒掉覆盖在分离胶表面的正丁醇，并用去离子水冲洗一次，倒置吸净残留的水。将配制好的浓缩胶液灌注入胶管内（约15mm），在凝胶表面轻轻加一层正丁醇液（约3～4mm），用于隔绝空气，使胶面平整。室温下静置约30～60min。观察胶和正丁醇之间的界面，判断胶是否凝固。胶凝固好后，倒掉覆盖在胶表面的正丁醇，并用去离子水冲洗一次，倒置吸净残留的水，准备加样。

（四）样品预处理和加样

1、取血清0.1ml、上样缓冲液0.9ml，混匀，在沸水中煮沸5min。

2、将胶管封底去掉，放入圆盘电泳槽中，套紧，不能有空的孔，将Tris-甘氨酸电泳缓冲液加入圆盘电泳上、下槽中，电泳缓冲液要盖过胶管口，然后用微量加样器（或注射器）将样品10μl加到胶管胶面内。

（五）电泳 上槽接负极，下槽接正极，先调电压为120v/浓缩胶，开始电泳，当指示染料进入分离胶后，将电压增加到80v/分离胶胶，继续电泳直至染料抵达距分离胶下端约1cm处，停止电泳，断开电源。电泳时间约1.0~1.5h。

（六）考马斯亮蓝染色

电泳结束后，取出电泳胶管，用长注射器针剥胶，一边注水一边推胶，直至胶出。将胶移至大培养皿中，精确量取并记录凝胶长度和指示染料的迁移距离（分离胶上缘到染料条带中心距离），然后将凝胶板浸入考马斯亮蓝染色液中0.5-1h，再用脱色液脱色1~2天，至背景无色为止。区带可作定性或定量分析。

（七）校正曲线的数据处理和分子量测定 精确量取并记录染色后凝胶长度、各标志蛋白质和各待测蛋白质区带的迁移距离（分离胶上缘到各蛋白质区带中心）。按下式计算各蛋白质的相对迁移率（Rm值）。

在半对数纸上，以各标志蛋白质的Rm值为横坐标（普通尺度），相应的分子量为纵坐标（对数尺刻度）作图，即得分子量校正曲线。根据各待测蛋白质的Rm值，查此校正曲线，可求各待测蛋白质的相对分子量。

五、注意事项

1．制胶过程中用正丁醇封住胶面是为了阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。

2．本法也适合于其他生物样品中蛋白质的分析。上样量不宜过大，否则会出现过载现象。尤其是考马斯亮蓝R250染色，在蛋白质浓度过高时，染料与蛋白质的氨基(－NH)形成的静电键不稳定，其结合不符合Beer定律，使蛋白质量不准确。

3．Acr和Bis有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时要注意保护。

             附表1 分子量范围与凝胶浓度的关系

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理

本实验采用不连续的聚丙烯酸胺凝胶电泳分离小麦苗过氧化物酶同工酶。系统的不连续性表现在以下几个方面：

（1）凝胶层的布连续性：凝胶由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。

（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH的布连续性：本实验采用碱性系统，电极缓冲液为pH8.9的Tris一HCl缓冲液，浓缩胶和分离胶缓冲液均为Tris一HCl 缓冲液，但pH值分别为6.7和8.9。

（3）电位梯度的不连续性：由于pH的不连续性，在电场中形成了不连续的电位梯度。（详见后述）

在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下，待分离的物质很好地分开。

下面以本实验要分离的小麦过氧化物酶同工酶为例，分别说明这三种效应的作用：

（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。

（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快，反之，分子量大，形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。

（3）浓缩效应： 待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下。①由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。这样，就在两层凝胶交界处使待分离的酶蛋白区带变窄，浓度升高。②在聚丙烯酰胺凝胶板中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶的pH为6.7，下层分离胶的pH为8.9。HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl^-布满整个胶板。待分离的酶蛋白样品加在顶层，浸在pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液中。 电泳一开始，有效泳动率最大的Cl^-迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。在pH6.7条件下解离度仅有0.1-1.0%的甘氨酸有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区，即低电导区。因为电位梯度V、电流强度1和电导率S之间有如下关系：

V＝I / S      

所以在电流恒定条件下低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子。本来夹在快慢离子之间的酶蛋白区带，在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。这就是所谓的浓缩效应。在此区带中，各种酶蛋白又按其电荷而分成不同层次，在进入分离胶前被逐步分离，形成若干条离得很近但又不同的“起跑线”。

后来，当酶蛋白和慢离子都进入分离胶后，pH从6.7变为8.9，甘氨酸解离度剧增，有效迁移率迅速加大到超过所有酶蛋白分子，从而赶上并超过所有酶蛋白分子。此时，快慢离子的界面跑到被分离的酶蛋白之前，不连续的高电位梯度不再存在。于是，此后的电泳过程中，酶蛋白在一个均一的电位梯度和 pH条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。与连续系统相比，不连续系统的分辨率大大提高，因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。

 

第二篇：实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳

实验7  聚丙烯酰胺凝胶电泳

原理

一  聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE），由称盘状电泳。这种电泳是在区带电泳的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带（厚度为10^-2cm），然后再进行电泳分离。

圆盘电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质的不连续性（discontinuity），凑巧在垂直柱形凝胶上分散出的区带也很象圆盘状（discoid shape），取“不连续性”和“圆盘状”的英文字头“disc”。因此英文名称为“disc electrophoresis”，中文直译为盘状电泳。

仪器装置：如图A所示，上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液（图中曲线表示缓冲液面）。上下槽的缓冲液分别有正负电极通入。下槽外壳在必要时可通入冷水促使降温，水流方向用箭头表示。上槽底部有许多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺的玻璃管。

              

 图A

    在圆盘电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一般电泳分离的电荷效应。由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。下面就圆盘电泳过程中的三种物理效应的原理加以说明：

1.样品的浓缩效应：由于电泳基质的4个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。（1）凝胶层的不连续性：浓缩胶：为大孔凝胶，有防止对流的作用。 分离胶：为小孔凝胶，也有防止对流的作用。样品在其中进行电泳和分子筛分离。

     蛋白质在大孔凝胶中受到的阻力小，移动速度快。进入小孔凝胶时遇到的阻力大，     

     速度就减慢了。由于凝胶的不连续性，在大孔胶与小孔胶的界面处就会使样品浓缩，

     区带变窄。（2）缓冲离子成分的不连续性。(3)电位梯度的不连续性。(4)pH的不连续

     性：在浓缩胶和分离胶之间有pH的不连续性，浓缩胶应有的pH应为8.3，分离胶应

     有的pH为8.9。

2.分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率，即所谓的分子筛效应。即使净电荷相似，也就是说自由迁移率相等的蛋白质，也会由于分子筛效应在分离胶中被分开。

    此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，小分子走在前面，大分子走在后面。而在柱层析方法中的分子筛效应，则是大分子通过凝胶颗粒之间的缝隙先流出来，而小分子则通过凝胶颗粒内的孔道后流出。

3.电荷效应：蛋白质混合物在凝胶界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白质区，但由于每种蛋白质分子所载有的电荷不同，因而迁移率不同。承载有效电荷多的，泳动的快，反之则慢。因此各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个个的圆盘状。在进入分离胶时，此种电荷效应仍起作用。

二 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理

1.性能：聚丙烯酰胺的机械强度好，有弹性，透明，相对地比较稳定，对pH和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。原料成分要采用高纯度制品，通过改变浓度和交联度，可以控制孔径变动在极广泛的范围，并且制备凝胶的重复性好，由于纯度高及不溶性，因此还适合于少量样品的制备，不致污染样品。

2.制备原理：聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（acrylamide 简称Acr）和交联剂亚甲基双丙烯酰胺（N,N,N,’N’-methylene bisacrylamide简称Bis）在催化剂的作用下聚合而成。

聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：

（1）化学聚合：化学聚合的催化剂多采用过硫酸铵（ammonium persulfate简称AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作为加速剂，最有效的加速剂为N,N,N’,N’-     -四甲基乙二胺（N,N,N,’N’-tetramethyl ethylenediamine,简称TEMED），其次为三乙醇胺及二甲氨基丙腈（3-dimethylaminopropionitrile,简称DMPN）。在叔胺的作用下，由过硫酸铵形成的氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合作用。叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时常会延迟聚合作用。分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用，一些金属也能抑制聚合作用。冷却可以使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。

     当聚合反应开始时，过硫酸铵溶于水产生自由基S₂O₈^2-→2SO₄^2-，这些自由基活化TEMED使之形成带不成对电子的活化分子。活化的TEMED与丙烯酰胺分子或甲叉双丙烯酰胺分子结合时能转移自由基使之活化。活化的丙烯酰胺可再以同样方式转移自由基活化另一分子的丙烯酰胺，并与之结合，这样不断活化下去，直至使所有的丙烯酰胺活化结合成长链，其末端的丙烯酰胺分子始终具有转移自由基的活性。但仅丙烯酰胺的多聚体只能形成长链，尽管粘稠，但不能形成凝胶。（2）光聚合：光聚合通常用核黄素为催化剂。不一定加TEMED即能聚合，但加入则可加速聚合。

甲叉双丙烯酰胺是由两个丙烯酰胺分子靠甲叉基相互连接构成的，其中的两个丙烯酰胺都可以分别被活化的TEMED所活化，而后再不断活化丙烯酰胺分子结合成长链；或者分别被已形成长链的丙烯酰胺链活化连接；或者一边被TEMED活化后与丙烯酰胺形成长链，另一边与已合成的丙烯酰胺长链结合等，其反应是随机的，多种多样的，但无论如何反应，在形成的丙烯酰胺链之间由于甲叉双丙烯酰胺的横链而被连接起来，最终形成立体的网状结构。可见甲叉双丙烯酰胺是一种引入横链的交联剂。这样按一定比例的Acr和Bis在AP和TEMED的催化下形成一种具有多孔、多分枝而又相互连接的聚丙烯酰胺凝胶。

     （2）光聚合：光聚合通常用核黄素为催化剂。不一定加TEMED即能聚合，但加入

      则可加速聚合，用核黄素进行光聚合的优点是：①核黄素的用量很低(1mg/ml);②通

      过光照可以预定聚合时间，但光聚合的凝胶孔径较大，而且随时间延长而逐渐变小，

      不太稳定，所以用它制备大孔凝胶较适合。化学聚合的凝胶孔径较小，因而采用过

      硫酸铵-TEMED催化系统制备小孔凝胶（分离胶），而且各次制备的重复性较好。

３.凝胶浓度和交联度与孔径的大小关系：凝胶浓度与被分离物的分子量大小关系，大　　　

　致如下表所示：

       M_r范围与凝胶浓度的关系

聚丙烯酰胺凝胶的网孔大小、机械强度、弹性均由胶的总浓度与Bis的浓度比及聚合的条件来决定。孔径与总浓度有关，总浓度越大，孔径则相应变小，机械强度增强；总浓度越小，则相反。当总浓度不变时，甲叉双丙烯酰胺（Bis）的浓度在5%时孔径最小，高于或低于此值时，聚合孔径相对变大。因此，配胶时可以通过改变丙烯酰胺的总量和甲叉双丙烯酰胺的含量，作为控制凝胶孔径大小的方法。

聚丙烯酰胺凝胶形成的网孔在电泳过程中具有分子筛的作用。因此在制备凝胶时，应该根据被分离物质的分子大小来选择凝胶的浓度。

    常用的所谓标准凝胶是指浓度为7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能得到满意的结果。当分析一个未知样品时，常常先用7.5%的标准凝胶或用4%~10%的凝胶梯度来试测，而后选出适宜的凝胶浓度。

    用于研究大分子核酸的凝胶多为大孔径凝胶，太软，不易操作，最好加入0.5%琼脂糖。有的在3%凝胶中加入20%的蔗糖，也可增加机械强度而不影响孔径大小。

三 常见的几种蛋白质染色染料

1.    氨基黑10B(amino black 10B)：C₂₂H₁₃O₁₂N₆S₃Na₃ M_r=715,λ_max=620nm~630nm.氨基黑是酸性染料是最常用的蛋白质染料。但用氨基黑10B染SDS-蛋白质时效果不好。氨基黑染不同蛋白质时的着色度不同、色调不一（有蓝、黑、棕等）。

2.    考马斯亮蓝Ｒ250(Comassie brilliant blue R250)：染色灵敏度比氨基  黑高5倍。尤

   其适用于SDS微量蛋白质染色。

      考马斯亮蓝G250，又名Xylene brilliant cyaninG。染色灵敏度不如 R250，但比氨基

      黑高 3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白质而几乎无

      本底色，所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于做定量分析。

    聚丙烯酰胺凝胶电泳具有使样品区带浓缩变窄的作用，所以分辨率高，在很多情况下超过高速离心和常用的层析及一般电泳技术：设备简单，样品量小（1~100μg）；时间短，操作简便，可分离物质的分子大小范围广泛，由多肽到核糖核蛋白体及病毒都可以分离，亦可改变为超微量测定（10^-12~10^-9g），并可结合SDS来测定蛋白质亚基分子量；或测定核酸等的分子量。这种方法现在几乎取代了超速离心沉降法。它还可以结合等电聚焦电泳以提高分辨率。

    聚丙烯酰胺凝胶电泳用途较广，对生物高分子化合物能进行分离定性定量分析，又能用于制备mg水平的材料。  

操作方法

垂直板凝胶电泳

    目前常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳是垂直板型电泳，垂直板电泳是在两块垂直放置的、间隔几个mm的平行玻璃板中进行制胶的，所得的是垂直的平板状凝胶。具有以下特点：

1.    表面积大，易于冷却控制温度。

2.    电泳后易于取出凝胶。

3.    能在同一凝胶板上，同一操作条件下，同时比较多个样品。

4.    可做双向电泳。

5.    便于利用各种鉴定方法，尤其便于进行放射自显影。

一  垂直型制胶模具

一般的垂直板型制胶模具是由两块长短不等的玻璃块组成（或由两块等长的玻璃片，其中一块的顶端制成“U”形）。玻璃板的长边缘之间放置两条用特殊塑料制成的间隔条（根据所需胶的厚度，选用间隔条的厚度），以配套的制胶底座和夹子固定，确保无泄漏的孔隙，即可灌胶。如无配套的制胶底座，则在两块玻璃板之间夹好隔条后，于板的两侧及底部用医用胶带或粘胶纸带封好，将1%的琼脂糖溶解，冷至50℃左右，沿模具的两边条内侧用滴管滴入，封住缝隙，以免灌胶时胶液泄漏。在较长的制胶模具中灌注胶液时，可将模具倾斜，与桌面成45~60°角，将胶液注入两块玻璃板之间的空隙中，不断轻敲玻璃板，使气泡上浮排出，一直灌到模具的顶部，此时可将模具放置成10°角，以降低泄漏的可能性，立即插入样品孔模板（或称梳子），注意梳齿的边缘不能带入气泡。室温时聚合需要40分钟左右，观察梳齿附近凝胶中呈现光线折射的波纹时，即表示聚合反应已完成。使用凝胶前，先撕去凝胶底部的胶条，将凝胶及模具安装在电极槽中，然后拔出梳子，立即用水冲洗孔格（此步很重要！因为取出梳子后，梳子上面吸附的和胶顶部少量未聚合完的丙烯酰胺会流入孔内，在慢慢聚合，使孔底不平，将影响电泳条带的形状不整齐）。垂直板型电泳装置和制胶模具见图B

二     贮液

1.贮液配方（Laemmli）(用量可依需要倍放)

3.    不同浓度（%）分离胶的配制（可按总体积按比例放大）

4.    浓缩胶配方

三     凝胶系统和制胶

垂直板型电泳的凝胶系统有两类。一类是不连续系统，主要用于蛋白质的分离；另一类是连续系统，只有一层凝胶，一种pH和一种缓冲系统，将样品透析或稀释，使样品的电导很低，这样人工造成电位梯度差异，也可使样品浓缩，达到同样分辨力。近年来在蛋白质和核酸的凝胶电泳研究中，广泛使用着这种连续系统。

      1.分离胶的制备：将贮液由冰箱中取出，达到室温后，按表中的比例配制工作溶液， 

               分离胶先不要和过硫酸铵混合，分别放在真空干燥器中抽出溶解的空气，取出赶快  

               混匀，灌入玻璃板之间的空隙，达到合适的高度后，用细滴管在已经加好的分离胶

              上面加3~5mm高的水层。加蒸馏水的目的，除隔离空气中的氧外，并能消除分离胶

              

             

             

             

             

             

                                    图B

             

             

             

             

             

             

             

             

             

             

            表面的曲度，使凝胶表面平坦，否则会影响带形和分辨率。因此着一步操作要特别

              小心，尽量防止水与胶液的混合。注意不要打搅凝胶液面，切忌加水时成滴状坠入

              胶液，这样会使顶部凝胶浓度变稀，以致改变预期的凝胶孔径，或从而造成凝胶表

              面的不平坦。即使小心地操作，凝胶顶端约1~3mm有时也受影响，往往凝聚不良或

              孔径改变，使这一区域内所形成的区带的迁移率值不可靠。

  水层放好后，静置胶液进行聚合反应，聚合时温度要与电泳时的温度相同，正常情况下10分钟即开始聚合，应控制在30~60分钟聚合完成。

                  刚加水时看出有界面，随后逐渐消失，等到再看到界面时，表明凝胶已经聚合。

              再静置30min使聚合完全。

    2.浓缩胶的制备：当分离胶完全聚合后，甩去分离胶表面的水层，用滤纸条（无毛边）吸去残留的水液，滤纸尽量不要接触凝胶表面。按比例混匀浓缩胶（最好预先抽气，使用是混合，先用这种凝胶液漂洗一下分离胶顶，除去漂洗液后，将浓缩胶液加入玻璃板之间剩余的间隙，并立即插入样品孔模板（或称梳子），注意观察凝胶的聚合过程，观察梳齿附近凝胶中呈现光线折射的波纹时，即表明聚合反应已经完成。

              3.上样

               样品的用量与凝胶板厚度有关系。对2mm厚、10mm宽的样品槽，用约20μl样品

            液；对4mm厚、10mm宽的样品槽，用约40μl样品液。每μl样品液约含0.1~10μg样品。形成的样品液层约1mm高。

               在样品液中常加入上样缓冲液（40%蔗糖+溴酚蓝）。一般情况下，上样缓冲液与样品的比例为1：1~1：2为最宜。   电泳过程同垂直管形盘状电泳。

              4.电泳

    将电泳槽和电泳仪连接,上槽为负极,下槽为正极。在电泳过程中，一般要求电流保持稳定，这时可见电压升高。电泳时间与所用缓冲液和样品有关，一般可根据指示染料的迁移来决定，如指示剂染料已迁移到距分离胶的下端1cm时，就可停止电泳，关闭电源，取出凝胶装置。

                缓冲液可再行使用，但应注.上下槽缓冲液不能混合或互换，因下槽混入了催化剂及氯离子。如将后槽的缓冲液用于前槽，则影响电泳。

              5.剥胶

               电泳结束后，从电泳装置上卸下制胶模具，取下制胶板中的短玻璃板及间隔条，用间隔条慢慢将凝胶剥下。一般剥胶方向是从浓缩胶端开始。剥胶时注意不要损伤凝胶表面。

 6.固定：为防止凝胶内已分离成分的扩散，需要进行固定。只要把剥下的凝胶浸泡在7%乙酸或12.5%三氯乙酸的水溶液中几分钟即可；或浸泡在7%或12.5%三氯乙酸配制的染色液中，同时进行固定和染色。

7.染色：

（1）蛋白质的一般染色方法见下表

蛋白质的染色方法

(2)银染色法：此方法灵敏度高，适合于微量样品分析。

①电泳后立即将凝胶浸泡在固定液（500ml乙醇、100ml冰乙酸、400ml蒸馏水）中，至少30min，如有必要，凝胶可在固定液中过夜。这一步可使蛋白质沉淀，并使SDS从凝胶中扩散出来。

②将凝胶放在浸泡液中（75ml乙醇、17.00g乙酸钠、戊二醛（25%W/V）、0.50g硫代硫酸钠（5H₂O），用蒸馏水溶解后定容到250ml）中30min 。

③用蒸馏水洗3次，每次5min。

④将凝胶在银溶液（0.25g硝酸银、50μl甲醛、加蒸馏水至250ml）中放置20min .

⑤在显色液（6.25g碳酸钠、25μl甲醛，以蒸馏水溶解后，定容至250ml）中放置2~10min。视蛋白带显示深棕色为止。

⑥为终止反应，将凝胶放在终止液（3.65g EDTA-Na.2H₂O，用蒸馏水定容到250ml）中10min 。

⑦用蒸馏水洗3次，每次5~10min 。

⑧如欲保存，将凝胶在保存液（25ml87%甘油，用蒸馏水加至250ml）中放置20~30min ，然后将凝胶放在玻璃板上，再用保存液浸湿的玻璃纸包住凝胶在室温下凉干。注意不要将凝胶加温，这样会使银染色漂白。

  以上银染色的每一步都应在日光下进行，并且均匀地震荡，银染色用的试剂纯度以及蒸馏水的纯度都极大地影响银染色的质量。如聚合的甲醛或戊二醛不能使用。要用蒸馏水做进一步的无离子处理，最好使用超纯水。

8.脱色及保存

    将染色的凝胶放入脱色液中，轻轻地振摇脱色，经常更换新溶液，直到染料不再洗出，背景几乎无色为止。

脱色后的凝胶放在7%醋酸溶液中 ，可以长期保存。

             

试剂和器材

1.丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺：一般用电泳做定性分析工作，用分析纯的Acr和Bis，即可获得满意的结果。无需对试剂做进一步的纯化。

    Acr和Bis不纯时（主要杂质是丙烯酸）会使聚合不均一，或聚合时间延长甚至不聚合。对于精细的分析工作，尤其是定量分析工作和制备工作，要求严格的可重复性或要求在波长260~280nm无吸收，就需要纯度更高的Acr和Bis ，可将商品的Acr和Bis重结晶。

    Acr 重结晶方法：将Acr溶于50℃氯仿中（70g/L），热过滤。冷却到－20℃结晶，用冷的布氏漏斗过滤收集结晶。用冷氯仿淋洗，真空干燥。Acr的熔点为84.5±0.3℃。

    纯化的Acr水溶液的pH是4.9~5.2。只要此pH值变化不大于0.4pH单位，就可使用。反复进行这一重结晶过程，并不能绝对纯化Acr。因为 Acr的水溶液（尤其是碱性时）总不断水解放出丙烯酸和NH₃、NH₄⁺，使pH略有下降。用离子交换技术可除去丙烯酸，但过程复杂，无此必要。

    Bis的重结晶：将12gBis溶于40~50℃的1000ml丙酮中，热过滤。慢慢冷却到－20℃，过滤或离心收集结晶。用冷丙酮洗涤后，真空干燥。Bis 的熔点为185℃。

试剂的贮存：固体Acr和Bis需贮存于棕色瓶中，保持干燥和较低温度（4℃最好）是相当稳定的。如保存不当，在超声波、γ-辐射或天然光作用下，Acr自身能聚合成链、（烯基间反应）。酰胺基也会进行缩合，形成亚胺桥而交联，试剂失效。

     Acr和Bis 的贮液，会由于水解作用而形成丙烯酸和NH₃。溶液装在棕色瓶中，贮于冰箱（4℃），能部分地防止水解。但也只能贮存1~2个月。可测pH值（4.9~5.2）来检查是否失效。失效溶液不能聚合。

     Acr和Bis是神经性毒剂，同时对皮肤有刺激作用。操作时要十分小心，避免与皮肤接触。大量操作时（如纯化）可在通风橱内进行。

     Acr的半数致死量（对小鼠）LD₅₀=170mg/kg。

2.   N，N，Nˊ，Nˊ-四甲基乙二胺（TEMED）：应密封避光保存。

3.   过硫酸铵溶液：最好当天配制。在冰箱中贮存也不能超过一星期。

器材：

1.    电泳仪直流稳压电源

2.    垂直板型电泳槽及配套的制胶模具。

附：

一 蛋白质超薄凝胶电泳

    电泳技术是利用带电粒子在电场作用下以不同的速度向电荷相反方向运动的现象来对某些化学或生物化学组分进行分离分析的，它已经成为生物化学和分子生物学实验中对蛋白质和核酸分子进行检测的最常规工具。目前蛋白质电泳通常采用垂直平板，分离介质为聚丙烯酰胺凝胶，凝胶厚度一般在0.75~1.5mm。但由于电泳过程中产生的焦耳热，将在凝胶中央产生一个径向的温度梯度，从而导致带电粒子产生径向的移动梯度，结果使区带展宽，减低分辨率。凝胶越厚，径向温度梯度越大，电泳条带越宽，所以凝胶厚度是影响电泳分辨率的一个主要因素。降低厚度到0.5mm以下，在染色和照相过程中容易使胶破碎，而且容易粘板。如果直接对电泳方板进行化学处理，为其涂渍一层亲水性的薄膜，在凝胶过程中，该膜上所带的双键也参加聚合，因此能够牢固地结合聚丙烯酰胺凝胶，从而克服了凝胶粘板的情况。

方板的亲水性处理

    将方板在10%的NaOH中浸泡1h，洗洁精彻底清洗，流水冲净，去离子水中洗3次，凉干；乙醇擦拭，凉干；用擦镜纸沾取改性液（1ml95%乙醇加入10μlMAPS和10μl冰醋酸），均匀涂布玻璃板表面，静置10min，再用擦镜纸沾取95%乙醇单向擦拭玻璃板，然后在沿垂直方向擦拭，重复3次此擦拭过程，凉干。

凹板的硅烷化处理

    将凹板用清水、洗洁精和去离子水彻底清洗，烘干；乙醇擦拭，凉干。以滤纸沾取硅烷化溶液（7%二氯二甲基硅烷的氯仿溶液）均匀涂布玻璃板表面，烘干，水清洗，烘干；乙醇擦拭，凉干。

制胶和电泳

    将处理好的玻璃板夹上0.4mm厚的夹条，装在制胶架上，按常规PAGE制胶的方法灌制凝胶。

注意事项

1.玻璃板的清洁程度至关重要，一定要彻底清洗，一种最重要的判断方法是，当用乙醇擦拭玻璃板时如果出现彩晕，则表明玻璃板已经洗净。

2.如果在灌胶时发生漏夜，需要重新处理两块玻璃板，这是因为MAPS能够通过水溶液污染凹板，在起胶时容易撕裂凝胶。

3.最好每次实验都用NaOH处理方板，因为玻璃板表面硅羟基多以—Si—O—Si—状态存在，对硅烷化呈惰性反应，NaOH能使表面硅羟基更多地以—Si—OH形式存在。

4.MAPS也可以用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷（KH-550化学纯）代替。

二 利于蛋白质回收的染色脱色方法

    SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和由等电聚焦（IEF）、SDS-PAGE组成的双向电泳不仅是分析、分离蛋白质的常用方法，而且也逐渐成为制备蛋白质的有效手段：从凝胶中制备的蛋白质可以用于蛋白质的测序或制备抗体等。但现在常用的染色-脱色方法不仅耗时长，而且由于冰醋酸的作用而不利于蛋白质从凝胶中洗脱回收。下面介绍一种利于蛋白质回收的方法。

    染色方法凝胶先用染色液( 0.1%考马斯亮蓝R-250、50%乙醇、7%冰醋酸)振荡染色20min，然后用蒸馏水反复冲洗后，浸入250mmol/L KCl溶液中，直到背景清晰为止。

蛋白质的电泳洗脱

    用锋利刀片切取含目的蛋白的凝胶后，将它们放入透析袋中，加入适量洗脱液（25mmol/L Tris,192mmol/L甘氨酸，0.5%SDS，pH8.3）后，在水平电泳槽中恒流80mA进行电洗脱，直到凝胶无色为止，约需2.5小时。在洗脱液中按1∶20（体积比）加入冷丙醇，在－20℃静置30min后于4℃、12000g离心20min ,沉淀在室温下放置挥发掉丙酮后加入适量的SDS-样品溶解液，用分离胶为12.5%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检查洗脱效果。

三 简便的考马斯亮蓝G250蛋白质染色方法

    蛋白质电泳后染色方法有多种：氨基黑染色、考马斯亮蓝染色和印染色等。其中考马斯亮蓝染色克服了氨基黑染色灵敏度较低和银染法操作复杂、假阳性率高的缺点，是最常用的方法，但它仍存在一些问题，如考马斯亮蓝R250（CBB R250）背景深、耗时长；CBB G250灵敏度不高；二者所耗试剂均较多等。

    考马斯亮蓝CBB G250蛋白质染色方法，是一种经济快速、灵敏度高、几乎无背景的蛋白质染色方法。此种染色方法适用于SDS-PAGE和常规PAGE，而用于IEF凝胶染色则效果较差。该种染色方法历时短，5~10分钟即显现蛋白质条带而可进行初步观察，2小时染色达70%，4小时后染色基本达到饱和，染色背景颜色不深，漂洗1.5~2小时即可完全脱去背景色。

    染色液配制：

        1mol/L盐酸溶液（A），1g/L CBB G250溶液（B）；使用时用1mlA 

    液和15ml B液混合加水至1L，搅拌混匀。

    染色程序：

1.电泳完毕后，取出凝胶浸于5mmol/L盐酸溶液中，振荡1小时。

2.弃去盐酸溶液，重复操作1。

3.将胶置于染色液中，染色2~16小时，连续振荡。

4.弃去染色液，将胶置于1mmol/L盐酸溶液中脱色数小时（换液3~5次）后，即可进行结果观察和照相，并将凝胶保存在1mmol/L盐酸溶液中。