实验7 考马斯亮蓝考G-250染色法测定蛋白质含量

 一、目的

1、学习一种蛋白质染色测定的方法

2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法 

二、原理

蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。

考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，其所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合，形成蓝色的蛋白质染料复合物，在595nm处有最大吸光度，在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质染料符合物在595nm处的吸光度与蛋白质杭亮成正比，因此可用于蛋白质含量测定。

反应2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。在0.01—1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。 

三、材料、试剂与器具

（一）试剂

1、染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升。棕色瓶保存，该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。

2、标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。

3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在10—30mg/ml

（二）器具

1、试管及试管架

2、移液管（1ml,5ml）

3、可见光分光光度计 

四、操作步骤

（一）标准曲线的制作

 1、取7支试管，按下表加入试剂

2、将试管摇匀，放置20分钟。   

3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。   

4、以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

（二）样品的测定

1、取一支试管，加入未知浓度的蛋白质溶液0.2ml，蒸馏水0.8ml考马斯亮蓝试剂5ml.

2、将试管摇匀，放置20分钟。

3、比色测定吸光值A595nm，对照标准曲线求得蛋白质的浓度。 

五、注意事项

1、由于染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠，试剂背景值会因与蛋白质结合的染料增加而不断降低，因而当蛋白质浓度较大时，标准曲线稍有弯曲，但直线弯曲程度很轻，不致影响测定

2、测定工作应在蛋白质染料混合后2min开始，力争1hr内完成，否则会因蛋白质一染料复合物发生凝集沉淀而影响测定结果。

六、实验报告

绘制标准曲线，并将实验结果与其他蛋白质测定方法比较分析。

七、思考题

1、考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量的原理是什么？

2、考马斯亮蓝法有什么优缺点

Bradford 法的优点是

（1）灵敏度高，其最低蛋白质检测量可达1μg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化很大。

（2）测定快速、简便、只需要加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5min左右，颜色在5min至20min之间稳定性也很好。

（3）干扰物质相对其它方法少。

缺点是

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。

（2）仍有些物质干扰此法测定：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1mol/L的NaOH。

（3）标准曲线也有轻微的非线性。 

操作注意事项：不可使用石英比色皿（染色不易洗掉） ，可用塑料或者玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可以用乙醇或丙酮长时间浸泡。

721分光光度计的操作使用

① 在接通电源前，应对仪器的安全性进行检查，电源线接线应牢固，接地线通地要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再接通电源。

② 将灵敏度派或调至“1”档（放六倍率最小）。调波长调节器至所需波长。

③ 开启电源开关，指示灯亮，选择开关置于“T”，调节透光度“100％”旋钮，使数字显示“100.0”左右，预热20分钟。

④ 打开吸收池暗室盖（光门自动关闭），调节“0”旋钮，使数字显示为“00.0”，盖上吸收池盖，将参比溶液置于光路，使光电管受光，调节透光度“100％”旋钮，使数字显示为“100.0”。

⑤ 如果显示不到“100”，则可适当增加电流放大器灵敏度档数，但应尽可能使用低档数，这样仪器将有更高的稳定性。当改变灵敏度后必须按④重新校正“0”和“100”。

⑥ 按④连续几次调整“00.0”和“100”后，将选择开关置于A，调节吸光度调零旋钮，使数字显示“.000”。然后将待测溶液推入光路，显示值即为待测样品的吸光度值A。

⑦ 浓度 C 的测量。选择开关由“A”旋至“C”，将标准溶液推入光路，调节浓度旋钮。使得数字显示值为已知标准溶液浓度数值。将待测样品溶液推入光路，即可读出待测样品的浓度值。

⑧ 如果大幅度改变测试波长时，在调整“00.0”和“100”后稍等片刻（因光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间），当稳定后，重新调整“00.0”和“100”即可工作。

五、注意事项

比色皿使用注意事项：

① 拿取比色皿时，手指不能接触其透光面；

② 装溶液时，先用该溶液润洗比色皿内壁2～3次；测定系列溶液时，通常按由稀到浓的顺序测定；

③ 被测溶液以装至比色皿的3/4高度为宜；

④ 装好溶液后，先用滤纸轻轻吸去比色皿外部的液体，再用擦镜纸小心擦拭透光面，直到洁净透明；

⑤ 一般参比溶液的比色皿放在第一格，待测溶液放在后面三格。

 

第二篇：考马斯亮蓝法测蛋白质含量

标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量

一、标准曲线

一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。

二、蛋白质含量测定方法

1、凯氏定氮法

2、双缩脲法

3、Folin-酚试剂法

4、紫外吸收法

5、考马斯亮蓝法

三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作

（一）、试剂：

1、考马斯亮蓝试剂：

考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H₃PO₄，用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H₃PO₄。

2、标准蛋白质溶液：

纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。

（二）、器材：

1、722S型分光光度计使用及原理（）。

2、移液管使用（）。

（三）、标准曲线制作：

1、

2、以A_595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。

1）、利用标准曲线查出回归方程。

2）、用公式计算回归方程。

3）、或用origin作图  ，测出回归线性方程。即A_595nm=a×X(   )+6

一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。

4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。

（四）、蛋白质含量的测定：

样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A_595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。

一般被测样品的A_595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A_595nm值太大，可以稀释后再测A_595nm值，然后再计算。

（五）、注意事项：

1、玻璃仪器要洗涤干净。

2、取量要准确。

3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。

4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。

药品的配制（磷酸缓冲液的配制）

一、药品的配制步骤

（一）、实验准备：

1、            准备所需的药品和玻璃仪器。

2、            洗涤。（怎样洗涤算干净？）

（二）、计算：

1、百分比浓度计算：

1)、G/V比

例如配1% NaCl，称1g NaCl溶于100ml 水。

2）、V/V比：

例如配75%乙醇100ml，75%×100%=100%×X,  X=75ml。取75ml无水乙醇，加25ml蒸馏水。

乙醇：乙醚：丙酮=2：1：2配500ml，各取200 ml，100 ml，200 ml混合。

3）G/V比：用的较少，如计算灰分中某种元素如Fe的含量。

2、摩尔浓度计算：注：药品的分子量一般在标签中注明。

1）、0.1M或0.1mol/L NaCl配100ml。

M=质量/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g   摩尔数=G（g）/摩尔质量

2）、0.1mMNaCl配100ml

mM=毫摩尔数/体积（L）    称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g 

毫摩尔数=G（mg）/摩尔质量

3）、0.1uNaCl配100ml

mM=微摩尔数/体积（L）    称取NaCl0.1×0.1×40=0.4mg

微摩尔数=G（ug）/摩尔质量   称取NaCl0.1×0.1×40=0.4ug

3、            混合溶液配制的计算：

如配3uMEDTA，2.25mM NBT以及60uM         溶液100ml，用50mM磷酸缓冲液配制。

注意：1、分别标定体积计算

2、分别配制再混合，但总体积不能   为100ml

（三）、标量：

1、根据需要选择不同量程的天平根据要求去不同精度的测量器，如量筒或移液管。

2、电子分析天平的使用。

（四）、溶解：

1、根据药品配置要求选择溶剂。蒸馏水，双蒸水，无离子水等。

2、只能用烧杯溶解。注意加入溶剂只能加入总体积的2/3左右，剩余溶剂洗涤烧杯三次左右，直到洗涤干净。

小常识：药品标签中一般标识有药品的溶解性能和分子式，可根据分子式和所学的常识判断药品的结构和性质特点（包括溶解性质）。

如酸碱两性物质的配制（AA、蛋白质、核苷酸等）如果溶解性能不好可以用稀酸或稀碱促进溶解，但pH应在被要求的范围内。

3、加热促进溶解，但注意应在配制的范围内有的药品还需水溶加热较好。如:配0.1%的淀粉，水裕加热（温度在80-90^。C），过量会糊化。

（五）、定容：

1、用容量瓶定容；

2、用玻璃棒引流或用小漏斗；

3、用溶剂加入到接近刻度，然后用滴管加入到刻度。要求刻度与液体凹面相切为止（眼睛可视）；

4、上下窑洞容量瓶几次，混合均匀即可。(注意不再定容了，防止溶液漏掉。)

（六）、装入试剂瓶，贴上标签。

标签应注明以下内容：药品浓度、名称、配制人、配制日期等。

（七）、清理实验场所。

二、磷酸缓冲液的配制。

（一）、配制0.2mol/L即0.2M pH=6.8的磷酸缓冲液。用磷酸氢二钠—磷酸二氢钠做缓冲液。

选用药品：Na₂HPO₄·12H₂O（碱）和NaH₂PO₄·12H₂O（酸）配缓冲液100ml。书中说明。

（二）、计算 ：

1、注：书中有注明配置的量。

2、计算：Na₂HPO₄·12H₂O称取71.64×0.1=7.164g

NaH₂PO₄·12H₂O称取 31.21×0.1=3.121g

3、含有不同结晶水的换算。

书中配1/15mol/L的缓冲液配1L，书中用Na₂HPO₄·2H₂O需要11.87g/L但用Na₂HPO₄·12H₂O需多少g？

11.87=（178/358）×X，X=23.87g。

（三）、分别配制缓冲液各100ml（根据需要确定配制的量）。

即：0.2M  Na₂HPO₄·2H₂O和NaH₂PO₄·2H₂O100ml。

（四）、按书中的量配制取量再混合。

如：pH=6.8，分别去缓冲对49ml和51ml。

（五）、用pH试纸ceni索赔的缓冲液的pH值，检测配置是否准确。

（六）如配50mM pH =6.8的缓冲液100ml ，以你配制的母液稀释即可。

计算：50×0.1=0.2×1000×X （L）；X =0.025L；

取0.2M  pH=7.2的缓冲液25ml，用蒸馏水定容至100ml即可。