蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法

[实验目的]

学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量的方法

[实验原理]

[器材与试剂]

器材

722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支

试剂

1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA），配制成1.00mg/ml。

2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。

[实验方法]

标准方法

1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。

2.加完染料20min后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A₅₉₅。

3.用标准蛋白浓度（mg/ml）为横坐标，用A₅₉₅为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。根据测得的未知样品的A₅₉₅，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算:

样品蛋白质含量(μg/g鲜重) =

SDS干扰实验

1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。

2.加完染料20min后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A₅₉₅。

[实验数据与结果分析]

（一）标准方法的数据和图

表1 考马斯亮蓝标准法实验表格

根据表1，以A₅₉₅为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。

图1 考马斯亮蓝标准法

根据线性拟合公式y=ax+b计算所测溶液的蛋白质的含量。

（二）SDS干扰数据和图

表2 考马斯亮蓝SDS干扰实验表格

根据表2，以A₅₉₅为纵坐标，SDS浓度为横坐标，作图2。

图2 考马斯亮蓝SDS干扰实验

理论上，十二烷基硫酸钠(SDS)对考马斯亮蓝法测蛋白质含量有干扰，随着SDS浓度的增加，其混合液的595nm处的吸收峰逐渐降低，而后有一小段回升，最后趋于渐近线。

[结论]：

1．  考马斯亮蓝标准法测得未知溶液中蛋白质含量为x mg/ml。

2．  干扰考马斯亮蓝方法的物质中，SDS的干扰分析情况。

[干扰实验结果分析]：

当溶液中存在一定量的SDS后所测得的吸光度比正常值相对减小。但是随着SDS浓度的增加，吸光度的减小量应没有呈现出很明显的规律。从SDS与蛋白质的作用机理来看，SDS可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构。SDS和蛋白质结合后使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。由于SDS 的存在，阻碍了染料与碱性氨基酸和芳香族氨基酸的结合，使得吸光度减小。由于SDS与染料分子对蛋白质的竞争结合，使得显色减弱，吸光度值降低，因此在曲线前段呈下降趋势；但由于SDS破坏氢键，使得蛋白质的空间结构更加伸展，一些原来包裹在结构中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸暴露出来，所以会有少量的吸光度回升；但最终SDS与蛋白质的结合达到所处溶液条件下的“饱和”时，过量的SDS就不起作用了，曲线是最后为平缓段。

要去除SDS的干扰，可以利用它与K⁺结合生成沉淀的性质将其去除。K⁺对考马斯亮蓝方法不产生干扰。

[思考与讨论]

1.用考马斯亮蓝法G-250测定蛋白质含量有何特点，操作过程中应注意什么？

答：Bradford 法的优点是（1）灵敏度高，其最低蛋白质检测量可达1μg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化很大。（2）测定快速、简便、只需要加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5min左右，颜色在5min至20min之间稳定性也很好。（3）干扰物质相对其它方法少。缺点是（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。（2）仍有些物质干扰此法测定：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1mol/L的NaOH。（3）标准曲线也有轻微的非线性。  操作注意事项：不可使用石英比色皿，可用塑料或者玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可以用乙醇或丙酮长时间浸泡。

2.考马斯亮蓝G-250和R-250各有何特点，在电泳染色方面有何异同？

答：考马斯亮蓝G-250和R-250的结构式不同，配方不同，染色方法也适合于不同性质的蛋白。考马斯亮蓝R-250即三苯基甲烷。每个分子含有两个-SO₃H，偏酸性，与蛋白质的碱性集团结合。在一定pH时，染料—蛋白复合物可以被完全解聚。与不同蛋白结合呈现基本相同的颜色，并且在比较宽的范围内(15-20μg)，扫描峰的面积与蛋白量有线性关系。通常用先固定，再进行染色和脱色的方法。考马斯亮蓝G-250即二甲花青亮蓝，其染色方法经常是对蛋白质同时进行固定和染色。这种方法的特点是快而简便，有时甚至不需脱色。但灵敏度略逊于R-250。同时考马斯亮蓝G-250对小肽染色效果很好。

3.试述几种主要干扰物质对考马斯亮蓝G-250蛋白测定法测定结果的影响及其作用机理。

答：SDS的存在会使相同条件下的吸光度值减小，其作用机理为：断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构。SDS和蛋白质结合后使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。由于SDS与染料分子与蛋白质的竞争结合，会使显色减弱，所以吸光度值减小。

Tris，乙酸，2-巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如TritonX-100，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。

4.说明各种蛋白质含量测定法中哪几种可以测出蛋白质的绝对含量，哪几种只能测定其相对含量，为什么？

答：严格地讲，只有凯氏定氮法可以测定蛋白质的绝对含量，因为每6.25蛋白质含1g氮，所以，通过氮含量的测定，可以得到蛋白质的绝对含量。其他的几种方法，由于都使用了标准蛋白制作标准曲线，所以，所测得的未知蛋白的含量，都是相对于标准蛋白含量而言的。

参考资料：
[1] 王德利等.食品中蛋白质的快速消化简便测定法.黑龙江八一农垦大学学报. 15（4）：80～82
[2]余冰宾.生物化学实验指导.清华大学出版社.2004
[3] 南亚,李宏高.考马斯亮蓝G-250法快速测定牛乳中的蛋白质.检测与分析.2007.10(12)：42～42
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[6]中国知网 http://www.cnki.net/

 

第二篇：考马斯亮蓝法测定乳与乳制品中蛋白质含量

Vo.l17,2010,No.3

????

粮食与食品工业

CerealandFoodIndustry

标准与检测

考马斯亮蓝法测定乳与乳制品中蛋白质含量

冯?昕,王吉中,尧俊英,呼玉侠

1

1

1

2

1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院?(郑州?450002)2.上海奇泓生物科技有限公司郑州分公司?(郑州?450013)

摘?要:建立了一种测定乳与乳制品中蛋白质含量的方法。利用6份乳与乳制品作为试验材料,通过考马斯亮蓝比色法测定其蛋白质含量。结果表明,工作曲线在0~0?18g/100mL范围内线性关系良好,线性相关系数为0?9993,平均加标回收率为98?13%,相对标准偏差小于5%,方法

的检出限为0?02g/100mL,该方法具有操作简便、重现性好、准确可靠等特点。

关键词:考马斯亮蓝法;乳与乳制品;蛋白质含量

中图分类号:TS252.7??文献标识码:B??文章编号:1672-5026(2010)03-0057-03

Determinationofproteincontentinmilkanddairyproductsby

CoomassieBrilliantBluemethod

FengXin,WangJizhong,YaoJunying,HuYuxia

1

1

1

2

1.CollegeofFoodandBiologyEngineering,ZhengzhouUniversityofLightIndustry(Zhengzhou450002)

2.ZhengzhouFilialeofShanghaiChihongBiotechnologicalCompany(Zhengzhou450013)

Abstract:Adeterminationmethodofproteincontentofthemilkanddairyproductsisestablished.SixmilkanddairyproductsweretakenastestmaterialbyCoomassieBrilliantBluecolorimetrictodeter?

minateproteinconten.tTheresultsshowthattheworkingcurveinarangeof0~0?18g/100mLleadsagoodlinearrelationship,thelinearcorrelationcoefficientis0?9993,theaveragerecoveryis98?13%,therelativestandarddeviationislessthan5%,thedetectionlimitis0?02g/100mLandthemethodissimple,reproducible,accurateandreliable.

Keywords:CoomassieBrilliantBluemethod;milkanddairyproducts;proteincontent

??蛋白质是生命活动的基础物质,是构成人体新生组织、维持人体健康的重要成分,它具有许多生物学功能;蛋白质作为人体最重要的营养素之一,它的分离与定性、定量分析是食品、药学和生命科学研究中经常涉及的重要内容,也是生物化学和其他生物学科、食品检验、生物药物分离提纯和质量检验中最重要的工作。目前食品中蛋白质含量的测量方法有紫外吸收法、凯氏定氮法、福林酚比色法、考马斯亮

[1]

蓝法等。紫外吸收法在测定酪氨酸和色氨酸含

收稿日期:2010-02-26??修回日期:2010-03-10

作者简介:冯?昕,女,19xx年出生,讲师,主要从事食品生物技术方面的教学与研究工作。

量差异较大的蛋白质时,有一定的误差;福林-酚比色法是灵敏度较高的方法之一,但是该法专一性较差,干扰物质较多,如酚类、柠檬酸、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用,且操作费时长,还要精确控制操作时间。凯氏定氮法是测定粗蛋白质的经典方法,但由于样品中非蛋白质含氮化合物的干扰,使得测定结果不能完全反映被测样品中真实蛋白质的含量。考马斯亮蓝比色法是19xx年由Bradford等人建立的一种测定微量蛋白质的方法,考马斯亮蓝所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水微区具有亲和力,通过疏水作用与蛋白质相结合,形成的蓝色蛋白质染料复合物,在595nm处有最大吸光度,在

[2]

标准与检测

一定的蛋白质浓度范围内,蛋白质染料复合物在595nm处的吸光度与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质含量的测定。

本试验采用考马斯亮蓝比色法测定了不同乳制品中蛋白质的含量并对该方法的线性关系、精密度、重复性、稳定性、回收率等方面进行了考察,旨在探索建立一种具有快速、简单、准确、抗干扰能力强、分析成本低廉等优点的测定乳与乳制品中蛋白质含量的方法。

[3-4]

冯?昕等:考马斯亮蓝法测定乳与乳制品中蛋白质含量

3)。

表1?不同蛋白质标准溶液的吸光度

蛋白浓度

/g?(100mL)

-1

00

0?010?040?080?120?160?18

吸光值0?0890?1570?2870?4350?5860?718

2.2?线性范围和检出限

工作曲线的蛋白浓度在0~0?18g/100mL范

围内符合比尔定律,线性关系良好。然后以试剂空白值吸光度的3倍标准偏差计算检出限,检出限为0?02g/100mL;检出限的验证,添加检出限浓度空白样加标,回收率达到92?5%,偏差小于20%。2.3?精密度试验

对6份乳与乳制品样品进行精密度试验,按照1.2.2方法测定蛋白质的含量,结果表明蛋白质吸光度的RSD为0?89%。2.4?稳定性试验

在同一乳与乳制品样品中加入4?0mL考马斯亮蓝G-250溶液,摇匀,在4h内,每隔1h测定1次蛋白质含量,计算其RSD值。由试验结果可知,同一乳品蛋白质含量的RSD为1?40%,表明4h内溶液稳定性良好。2.5?重复性试验

取一定量乳与乳制品样品6份按1.2.2试验方法进行检测,计算其蛋白质含量的RSD值。结果表明蛋白质含量的RSD值为0?95%,表明其重复性良好。

2.6?加标回收试验

对2份生鲜牛乳、2份纯牛奶和酸酸乳、优酸乳样品分别进行加标回收试验,每个样品浓度测定3次,结果见表2。

表2?加标回收试验结果

样品号123456

本底量/g0?03520?03840?03060?03110?01250?0113

加标量/g0?0050?0080?0100?0100?0200?040

测定均值

/g0?03870?04480?04180?04200?03120?0487

回收率/%96?396?5102?9102?296?094?9

1?材料与方法

1.1?材料和设备

2份生鲜牛乳:购自河南农业大学奶牛养殖基地;纯牛奶2份(不同品牌)、酸酸乳、优酸乳:购自郑州北环家乐福超市;考马斯亮蓝G-250(分析纯)购自中国医药公司,牛血清白蛋白(生化试剂)购自西安沃尔森生物技术有限公司,其余试剂均为分析纯。

UV-762紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)。1.2?试验方法

1.2.1?溶液的配制

标准蛋白溶液的配制:精确称取牛血清白蛋白100mg,用蒸馏水定容至100mL,配成1?0mg/mol的标准溶液。

考马斯亮蓝G-250溶液的配制:精确称取考马斯亮蓝G-250100mg,溶于50mL95%的乙醇,再加入120mL85%的磷酸,稀释定容至1000mL备用。1.2.2?乳制品中蛋白质含量的测定

分别准确移取一定量的乳与乳制品样品于试管中,加入4?0mL考马斯亮蓝G-250溶液,用蒸馏水定容至5?0mL,摇匀,在室温下反应5min,以空白(不加乳制品)溶液作参比溶液,分光光度计595nm波长处测定样品组的吸光度。

2?结果与分析

2.1?工作曲线的确定

在试管中分别精确移取牛血清白蛋白标准溶液0、0?1、0?2、0?4、0?6、0?8、1?0mL,加蒸馏水至1?0mL,然后在各支试管中分别加入4?0mL考马斯亮蓝G-250溶液,摇匀,室温下反应5min,在595nm波长处测定吸光度,以牛血清白蛋白标准溶液浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准曲

2

线。回归方程为Y=0?0071X+0?0089(R=0?999结果表明,回收率范围为94?9%~102?9%,平均加标回收率为98?13%,RSD<5%,准确度较

粮食与食品工业?

高,符合测定要求。

CerealandFoodIndustryVo.l17,2010,No.3

含量的测定方法,该法精密度高、稳定性和重现性

[5-6]

2.7?本法与国标凯氏定氮法比较好,抗干扰能力强,对仪器要求较低,简单、快捷、易行、准确度高,很适合大批量的乳与乳制品样品的测定,但本文仅对乳与乳制品中蛋白质含量进行了测

定,其中蛋白质的种类和单体含量有待进一步深入研究。除测定牛乳的蛋白质外,本法还可尝试推广

g/100mL

酸酸乳优酸乳

对6份乳与乳制品样品进行两种方法测定的配对t检验,统计比较结果见表3。t=1?628,P>0?1,说明两种方法无明显差异,利用考马斯亮蓝法测定样品的结果准确可靠。

表3?两种方法测定结果比较

样品号考马斯亮蓝法凯氏定氮法

生鲜牛乳生鲜牛乳纯牛奶纯牛奶

1

2

1

2

到其他保健食品、植物蛋白饮料等的蛋白质测定。

参考文献

[1]宁正祥.食品成分分析手册[M].北京:中国轻工业出版

社,1997:72-81.

[2]许家喜.蛋白质的检测方法与乳制品中蛋白含量测定

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ofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein?dyebindinn[J].(72):248-254.

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法的比较[J].中国生化药物杂志,2003,24(2):78-80.[5]段光顺,王?浩,曹慧婕.纳氏试剂分光光度法测定乳与

乳制品中蛋白质[J].中国卫生检验杂志,2006,16(2):238.

[6]贾忠建.乳及乳制品中蛋白质测定应注意的事项探讨

[J].中国卫生检验杂志,2006,16(11):1393.

AnalyticalBiochemistry,1976

3?523?58

3?843?88

3?063?113?113?18

1?151?12

1?081?06

2.8?干扰试验

在一定浓度的牛血清白蛋白溶液中加入不同浓

度的酚类物质和氨基酸,分别测定考马斯亮蓝蛋白质复合物的吸光度,结果发现不同浓度的没食子酸和甘氨酸对考马斯亮蓝牛血清白蛋白复合物的吸光度没有明显干扰。

另外为检查强化剂对本试验是否有干扰存在,在试验条件下用加有强化剂(强化铁和锌)的奶粉做干扰试验,发现强化剂对试验亦无明显干扰存在,试验结果与凯氏定氮法测定结果无差异。

3?结论

采用考马斯亮蓝比色法作为乳与乳制品蛋白质?行业信息

国家 营养强化大米重点研发生产基地!落户中粮

20xx年4月26日,国家公众营养改善项目重点倡导产品 营养强化大米!上市新闻发布会在国新办新闻发布厅召开,中粮集团大米部成为首批 全国营养强化大米重点研发生产基地!。

营养强化大米是指在普通大米中添加了维生素B1、维生素B2、烟酸、叶酸和铁、锌等营养素。据介绍,营养强化大米未来将逐步推广,替代当前营养物不足的普通大米主导地位。中国粮油(控股)有限公司副总经理、大米部总经理杨红表示,3月中粮旗下营养强化大米 全稻原米!已经在北京、上海等城市试销,6月以后这款产品将推向全国市场。 全稻原米!是大米部今年着手重点推广的大米产品,完整保留了普通白米加工过程中会流失的营养成分。此前,中粮旗下强化大米主要用于出口。大米部还向大会捐赠了15t 全稻原米!,这批赠品后期将由中国红十字基金会转赠给北京芳草地国际学校等相关单位,接收单位将进行家庭健康状况调查和4个月食用的效果测评。

公众营养与发展中心吴秀林副主任表示,大米部今后可加强与其沟通和合作,借助政府机构的权威性、严肃性,积极推动中粮米业的公信力、知名度。同时,借助政府调研机构的权威数据,对公众进行大米的营养知识普及。

该发布会由国家公众营养改善项目办公室、中国粮油学会营养分会和国家发改委宏观院公众营养与发展中心组织,旨在贯彻国办发(2001)86号文件?中国食物与营养发展纲要(2001-2010)#的精神、全面实施我国食物强化战略。(忠?良)