Elisa实验报告
实验名称：
酶联免疫吸附剂测定
实验原理：
酶联免疫吸附测定是一种免疫测定技术。测定中，先使抗原吸附在固相载体上，然后加待测的抗体，再用某种酶标记抗体，形成抗原-抗体-酶标记抗体的“双抗体夹心”，此时酶仍保有活性，同时标记抗体亦有免疫活性。之后再加入酶的底物，在酶的催化下产生反应并产生有色物，颜色深浅与待测物质的量直接相关。至此，酶的催化放大作用与免疫反应的特异性相完美结合，提高了测定的准确性与灵敏度。
实验材料与试剂：
1．聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 96孔)。
2．酶联免疫检测仪。
3．辣根过氧化物酶羊抗兔IgG。
4．包被液：0.05 mol/L 碳酸缓冲液（pH 9.6）：
Na2CO3 0.15g,
NaHCO3 0.293g，
蒸馏水稀释至100 ml。
5．稀释液（PBS-Tween）：
NaCl 8g,
KCl 0.2g，
KH2PO4 0.2g,
Na2HPO4·12H2O 2.9g,
Tween-20，0.5ml，
蒸馏水加至1000ml。
6．洗涤液：同稀释液。
7．封闭液：0.5 % （质量分数）BSA（用PBS配制）。
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酶联免疫吸附测定实验报告
ELISA
一 实验原理
酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。ELISA过程包括：抗原(抗体)吸附在固相载体上——包被，加待测抗体(抗原)，加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)-待测抗体(抗原)-酶标记抗体的复合物，在于该酶的底物反应生成有色产物。然后借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。
ELISA常用的有4种方法，分别是直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争法。在我们的实验中，采用的是间接法。主要步骤有：将抗原吸附于固相载体表面；加抗体，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物(测定底物的降解量=抗体量)。
二 实验用品及器具
1 聚苯乙烯微量细胞培养板(平板，96孔)
2 酶联免疫检测仪
3辣根过氧化物酶羊抗兔IgG
4 包被液
0.05mol/L 碳酸缓冲液(pH 9.6)
Na2CO3 0.15g
NaHCO3 0.293g
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Test1. Production of antibody
[principle]
1. In the special humoral immune response, antigen can stimulate immune system to produce specific antibodies. Each antigen molecule has several different antigenic determinants, so it can be recognized by different B cells and then these B cells will produce different specific antibodies that can bind with epitopes specifically. The immunity serum produced by using antigen to immune animal is a mixture of many different antibodies, called polyclonal antibody. The most common method to produce polyclonal antibody is using pure antigen to immune animal.
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ELISA实验数据处理方法
如果是新的数据，你只要双击图表，把它输入到图表的数据中，就可以拟和曲线。根据曲线方程式，计算出浓度。
方法：
1、拟和曲线：
输入第一行： 浓度值， 如0 10 50 100 400 输入第二行：该浓度下的调整后的
0 0.586 1.397 1.997 3.42 od值，如
选择这些输入的数据，用插入里的图表按钮，进入图表向导，在“标准类型”中选择“xy散点图”；在“子图表类型”中选择“折线散点图”，按“下一步”；选择“系列产生在行”，按“下一步”；数据标志，可以填写：如数据y轴，OD值；数据x轴，浓度；按下一步，点击完成。可得曲线图。 单击曲线，按右键，选择“添加趋势线”，在类型中，选择多项式；在选项中，选择显示公式，选择显示R平方值。
得到公式和R平方值。
也可以用上面说的方法： 双击图表，把它输入到图表的数据中，就可以拟和曲线。
2、计算浓度：
第一次实验：
标准曲线为：
y = -4E-05x2 + 0.026x
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ELISA原理 －－操作规则（新手适用）
酶联免疫吸附实验 ELISA
一．实验目的
酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。
二．实验原理
用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
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ELISA实验数据处理方法
方法：
1、拟和曲线：
输入第一行： 浓度值， 如0 10 50 100 400
输入第二行：该浓度下的调整后的od值，如0 0.586 1.397 1.997 3.42
选择这些输入的数据，用插入里的图表按钮，进入图表向导，在“标准类型”中选择“xy散点图”；在“子图表类型”中选择“折线散点图”，按“下一步”；选择“系列产生在行”，按“下一步”；数据标志，可以填写：如数据y轴，OD值；数据x轴，浓度；按下一步，点击完成。可得曲线图。
单击曲线，按右键，选择“添加趋势线”，在类型中，选择多项式；在选项中，选择显示公式，选择显示R平方值。
得到公式和R平方值。
也可以用上面说的方法： 双击图表，把它输入到图表的数据中，就可以拟和曲线。
2、计算浓度：
第一次实验：
标准曲线为：
y = -4E-05x2 + 0.026x
R2 = 0.9745
为例，已知OD值，计算浓度。
由于y = -4E-05x2 + 0.026x，所以可以得到：
4E-05x2 －0.026x ＋y＝0
ax2 ＋bx ＋y＝0
a＝4E-05；b＝ －0.026；
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ELISA缓冲液配方
书中ELISA封闭液：含5%脱脂奶粉或者5%BSA的PBS，请问5%BSA指的也是质量分数吗？，因为师姐笔记写的是体积分数，网上查了查也没弄清楚，请指教。
样品稀释液可以直接就用PBS稀释吗？文献上提到稀释液中也含脱脂奶粉或BSA，请指教 PBST中吐温-20的体积分数为0.05%，这个含量是固定的吗？1.含5%脱脂奶粉或者5%BSA的PBS，5%BSA用质量分数即可；
2.样品稀释液一般可以用洗液直接稀释，也可加入一些蛋白（如脱脂奶粉或BSA）或牛、兔等血清，要根据你的试验而定；
3.至于PBST中吐温-20的体积分数，可以0.05%—0.2%，可以在你试验过程中摸索。
4.提供一般科研用简单配方，这些你都可以在网上或别人的文章中查到，仅供参考： 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M
KH2PO4 0.2克
Na2HPO4·12H2O 2.9克
NaCl 8.0克
KCl 0.2克
Tween-20 0.05％ 0.5ml
加蒸馏水至1000ml
封闭液：
牛血清白蛋白(BSA) 5克
加洗涤缓冲液至100ml。
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ELISA基本步骤和主要试剂、材料
注意：本步骤为间接ELISA步骤
一 主要步骤
1 包被
取所要包被的物质，提前设计好所需浓度，根据包被孔数计算所需包被物的量，用包被液稀释至所需体积，分加至各孔中。
包被条件：两种选择：一是将ELISA板直接臵4℃过夜；也可以先臵37℃孵育2小时再转入4℃过夜。
2 洗涤
包被结束后弃掉包被液，用PBST进行洗涤，方法为PBST加满每孔，静臵5-10min，弃掉洗液，重新加满，重复洗涤3-5次，最后拍干ELISA板等待下一步封闭。 3 封闭
常用10%小牛血清，取第2步的ELISA板加封闭液至每孔，体积至少为所加包被液的两倍。封闭条件也有两种选择：直接臵于4℃过夜，或者臵于37℃温育2-4h，具体何种条件不同物质的ELISA可能不同。
4 洗涤
封闭结束的ELISA板进行洗涤，方法同步骤2。最后拍干等待加入一抗。 5 加入一抗
一抗即为你要检测的物质，一般加之前需要稀释，具体稀释倍数不同实验 不同需要自己摸索。一抗样品一般用包被液稀释，稀释到所需浓度后加入到相应孔中。反应条件为37℃孵育2h。
6 洗涤
具体同步骤4。
7 加相应HRP-标记的商品化二抗
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