【实验目的】
1.学习氨基酸纸层析法的基本原理
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术
【实验原理】
纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术,可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定;也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法,其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相,展层用的有机溶溶剂是流动相。在层析时,将样品点在距滤纸一端约2~3cm的某一处,该点称为原点;然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层,这样混合氨基酸在两相中不断分配,由于分配系数(Kd)不同,结果它们分布在滤纸的不同位置上。物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值(rate of flow, Rf)来表示。所谓Rf,是指在纸层析中,从原点至氨基酸停留点(又称为层析点)中心的距离(X)与原点至溶剂前沿的距离(Y)的比值:
在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。
【器材与试剂】
(一)器材
1.层析缸
2.点样毛细管
3.小烧杯
4.培养皿
5.量筒
6.喷雾器
7.吹风机(或烘箱)
8.层析滤纸(新华一号)
9.直尺及铅笔
(二) 试剂
1. 扩展剂(水饱和的正丁醇和乙酸混合液)
将正丁醇和乙酸以体积比4∶1在分液漏斗中进行混合,所得混合液再按体积比5∶3与蒸馏水混合;充分振荡,静置后分层,放出下层水层,漏斗内即为扩展剂。
2. 氨基酸溶液
0.5%赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸以及它们的混合液(各组份均为0.5%)。?
3. 显色剂
0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
【实验步骤】
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氨基酸鉴定
(纸层析法)
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白
一.实验目的
1. 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和方法。
2.学习氨基酸纸层析法的基本原理
3.掌握氨基酸纸层析的操作技术二.实验原理
二.实验原理
1)氨基酸的分离鉴定——纸层析法
纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术,可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定;也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法,其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相,展层用的有机溶溶剂是流动相。在层析时,将样品点在距滤纸一端约2~3cm的某一处,该点称为原点;然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层,这样混合氨基酸在两相中不断分配,由于分配系数(Kd)不同,结果它们分布在滤纸的不同位置上。物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值(rate of flow, Rf)来表示。所谓Rf,是指在纸层析中,从原点至氨基酸停留点(又称为层析点)中心的距离(X)与原点至溶剂前沿的距离(Y)的比值:
在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。
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实验一 氨基酸的分离与鉴定——滤纸层析法
目的要求
(1)通过实验,了解氨基酸滤纸层析法的原理。
(2)掌握氨基酸滤纸层析的操作方法。
原 理
滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析(它也并存着吸附和离子交换作用)。滤纸纤维上羟基具有亲水性,因此吸附一层水作为固定相,而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动称为下行层析,自下而上流动称为上行层析。流动相流经支持物时,与固定相之间连续抽提,使物质在两相间不断分配而得到分离。
溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示:
溶质结构、溶剂系统物质组成与比例、pH值、选用滤纸质地和温度等因素都会影响Rf值。此外,样品中的盐分、其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。
无色物质的纸层析图谱可用光谱法(紫外光照射)或显色法鉴定。氨基酸纸层析图谱常用的显色剂为茚三酮或吲哚醌,本实验采用茚三酮为显色剂。
本实验用单向上行层析法作标准氨基酸的标准曲线,用双向上行纸层析法作几种已知氨基酸的层析图谱。然后将其中的谷氨酸和天冬氨酸加以定量测定。
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实验七 氨基酸的分离鉴定——纸层析法
一、目的
通过氨基酸的分离,学习纸层析法的基本原理及操作方法。
二、 原理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法,它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。
惰性支持物是新华一号滤纸,其上含有很多的羟基,与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。水相因此称为静止相(固定相),有机溶剂称为流动相。
展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成,它们互相混合时便分成两相:一相是以水饱和了的有机相,另一相是以有机溶剂饱和了的水相。
分配系数(α)=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。
当用滤纸进行分配层析时,流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提,使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。
不同的氨基酸在一定的条件下,有其一定的Rf值,故可根据Rf值定性鉴定氨基酸,但通常用已知的标准氨基酸层析作对照,本实验就是如此。
l 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
l 层析溶剂由有机溶剂和水组成
l 物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移值)来表示的:
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生物化学实验报告
姓 名: XXXXX
学 号: XXXXXXXXXXXXXX
专业年级: XXXXXXXXXXXXXXX
组 别: 第X实验室
生物化学与分子生物学实验教学中心
一、实验目的
1、掌握薄层层析法的实验原理。
2、掌握氨基酸薄层层析法的基本操作方法。
3、掌握如何根据移动速率(Rf值)来鉴定被分离的物质(即氨基酸混合液)的方法。
二、实验原理
1、薄层层析法是色谱分析技术的一种。
是将吸附剂、载体或其他活性物质均匀涂铺在平面板(如玻璃板、塑料片、金属片等)上,形成薄层(常用厚度为0.25毫米左右)后,在此薄层上进行层析分离的分析方法。
一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相(展开溶剂)在固定相上流动时,由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样,不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样,点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同,因而可以彼此分开。(即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行,而将样品各组分分离开来)
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