9月份经验教训总结

生产部：李新乐

九月份在制备gp41项目的菌体时，蛋白表达时形成了包涵体。

在基因工程中，在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子 ，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体。包涵体的形成主要是因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子, 或环境不适, 无法形成正确的次级键等。

1、重组蛋白在宿主系统中高水平表达时,无论是用原核表达体系或酵母表达体系甚至高等真核表达体系, 都可形成包涵体。事实上, 内源性的蛋白质, 如果表达水平过高, 也会聚集形成包涵体。因此, 包涵体形成的原因主要是高水平表达的结果, 即合成速度太快, 以至于没有足够的时间进行折叠, 二硫键不能正确的配对, 过多的蛋白间非特异性结合, 蛋白质无法达到足够的溶解度等。

2、重组蛋白在大肠杆菌中表达时, 缺乏一些蛋白折叠过程中所需要的酶和辅助因子, 如折叠酶和分子伴侣等, 是包涵体形成的又一原因。

高效表达的重组异源蛋白在大肠杆菌中形成包涵体的影响因素有很多, 其中温度就是一个很重要的因素，提高温度有利于包涵体的形成。较高的培养温度由于加快了蛋白质的合成速度, 增加了无活性蛋白质集聚物的形成速度和疏水作用, 因此促进了包涵体的形成。在制备gp41项目的菌体时，在37度条件下诱导时，形成大量包涵体，再改用16度过夜诱导后就得到了改善，形成可溶性表达。

 

第二篇：12月份经验教训总结-李新乐

12月份经验教训总结

生产部：李新乐

大肠杆菌 E.coli 是基因工程中常用的表达工具，它不像真核基因表达系统那样可以对表达产物进行翻译后加工修饰，但是由于其遗传背景清楚，有多种表达载体、菌株和纯化系统，生长快，产量高，成本低，生产规模大和使用安全，操作简便，周期短，经济等很多优点，因此仍然是不可被替代的使用最为广泛的系统。

目标蛋白在大肠杆菌系统中表达的形式有两种：一种是在细胞内表现为可溶性的蛋白质，一种是在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒，即产物以包涵体的形式存在。

包涵体是外源基因在原核细胞中表达，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性、无活性蛋白质颗粒，显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分区别明显。包涵体一般含有50%以上的重组蛋白，其余成分为RNA聚合酶，核糖体元件，环状和缺口质粒DNA，外膜蛋白OmpC、OmpA和OmpF以及脂质、脂多糖、肽聚糖等。一般难溶于水，只溶于变性剂(如盐酸胍，尿素等)。

包涵体的形成比较复杂，不仅与宿主细胞，表达基因有关，与外界培养环境也有很大关系。关于包涵体的形成，主要有以下几种论点：

①与胞质内蛋白质生成速率有关，基因表达速度太快，新生多肽无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体。动力学模型表明: 活性蛋白的产率取决于蛋白合成、折叠、聚集的速率,在蛋白质高水平表达时，新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白正确折叠的速率就会导致包涵体的形成；

②局部高浓度的新生肽，加快非专一性沉淀。

③宿主菌的培养条件，如培养基营养成分、温度、pH值、离子强度等因素，都会影响包涵体的形成。当温度超过某一种蛋白的变性温度后，随着温度增加，蛋白质凝集量增加，当环境的pH接近某一种蛋白的等电点时，蛋白的凝集也增加，包涵体形成增多。

④蛋白质自身的稳定性。目的基因所表达的重组蛋白，对大肠杆菌来说属于异体蛋白，大肠杆菌表达体系内不具备某些哺乳动物蛋白(重组蛋白)翻译后修饰所需的酶类和辅助因子，如折叠酶或分子伴侣等，致使中间产物大量聚集形成包涵体。

⑤重组蛋白的氨基酸组成。研究显示含硫氨基酸多的重组蛋白形成包涵体的可能性较大。可能是因为宿主细胞还原性环境使表达蛋白中二硫键的稳定性下降，出现多余或错配的二硫键。