实 习 报 告

X  X  学  校

2015 年 1 月 13日

1、实习时间、地点和实习单位

2、实习目的

通过食品微生物检验实习，掌握培养基的配制、包扎及灭菌；正确采集样品并对样品进行稀释、滴加、培养；菌落观察、鉴定与计数；数据处理、分析等方面内容，并结合生产和科研技术的发展，开设较高的综合性实验为主，运用综合的实验方、实验手段对我们的知识、能力、素质形成综合的培养。为我们今后从事各种与食品相关的工作打下基础。

3、实习过程概述

3.1参加认识实习动员大会

   20##年11月8日上午由黄大川、王瑶琼2位老师召开了微生物实习动员大会。会上，老师们说明了实习目的、内容、时间、地点，着重强调了此次实习的自主性和和注意事项，另外还应遵守实验室的规章制度，保持高度的安全意识。

3.2实习内容

一、腐乳中细菌含量的检测

1、实验材料和设备

    1ml移液管 5支,1000ml、500ml、100ml的烧杯各1、1、2个,250ml锥形瓶 3个，100ml量筒1个，研钵1个,滴定管1支,试管5支,试管架1个，玻璃棒1根,培养皿 12个,涂布器1个,洗耳球1个,酒精灯1盏,电磁炉1个，天平1台,药匙1个，pH试纸，标签纸1张，纱布、棉花、线、报纸若干，高压蒸汽灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台。

2、牛肉膏蛋白胨培养基的配制

    配方：牛肉膏3g    蛋白胨10g   NaCl 5g    琼脂15—20g    水1000ml         pH 7．4—7．6

    步骤：称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→倒平皿→接种→培养

3、样品的稀释

 ①预处理：在天平上称取25g 样品，置于研钵中，然后加50ml无菌水在无菌室里研磨，磨碎后再加175mL 无菌水于研钵中，最后转至250ml锥形瓶中，充分振摇后，制成1:10 的样液。

 ②十倍稀释：

    用1mL 灭菌移液管吸取1:10 样液1mL ，沿管壁缓缓注人盛有9 mL无菌水的灭菌试管中（注意吸管不要触及稀释液面），充分振荡试管使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。接着用另一支吸管按上述操作重复，依次制成10倍梯度系列的样品匀液。每稀释1次，换用1支1mL灭菌移液管。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。

4、倒平皿前准备

 开启无菌工作台，先紫外线灭菌，30min后再进入。（研钵用酒精擦拭后，放在无菌室进行紫外灭菌）

5、倒平皿

    倒入的培养液要到培养皿高度三分之一的位置，至少倒10个培养皿。倒完培养皿后，将其放在一旁等待冷却凝固。

6、接种

根据对样品污染状况的估计，选择3 个适宜稀释度的样品匀液，根据腐乳的污染情况估计我们选用了10-11、10-12、10-13  三个稀释度，进行10倍稀释时，吸取0.5 mL 样品匀液于无菌培养皿内，每个稀释度做了3个平皿。同时，留1个培养皿作空白对照。（注：每个稀释度做三个培养皿是为了降低误差，使结果更准确，因为我们用的是市售型腐乳，污染情况较严重，所以选用了这三个稀释度）

7、渗透

    将接种后的培养皿放置30min，使样液渗入培养基。

8 、倒置培养

 将渗透好了的培养基翻过来，放在温度为36±1℃ 的恒温箱中培养 24±1h。

9、实验结果

 选取菌落数在30 CFU～300CFU 之间，无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数，低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

二、腐乳中霉菌含量的检测

1、实验材料和设备

研钵1个，100mL量筒1个，滴定管1支，1 mL移液管6支，试管5支，玻璃棒1根，培养皿12个，500mL烧杯一个，涂布器1个，洗耳球1个，药匙1个，试管架1个，酒精灯1盏，电磁炉1个，天平1台，pH试纸，250mL锥形瓶3个，标签纸1张，纱布、棉花、线、报纸若干，高压蒸汽灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台。

察氏培养基的配制

    配方：硝酸钠3g   磷酸氢二钾1g   MgSO4·7H2O 0.5g    氯化钾0.5g  硫酸亚铁0.01g   蔗糖30g   琼脂20g    蒸馏水1000mL

    步骤：称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→倒平皿→接种→培养

3、4、5跟细菌含量的检测步骤一样

6、接种

根据对样品污染状况的估计，选择3 个适宜稀释度的样品匀液，因为霉菌的菌落较大，所以我们选择了10-11、10-12、10-13   三个稀释度，进行10倍稀释时，吸取0.5 mL 样品匀液于无菌培养皿内，每个稀释度做了3个平皿。同时，留1个培养皿作空白对照。（注：每个稀释度做三个培养皿是为了降低误差，使结果更准确）

7、渗透

    将接种后的培养皿放置30min，使样液渗入培养基。

8 、倒置培养

 将渗透好了的培养基翻过来，放在温度为27±1℃ 的恒温箱中培养5天。

9、实验记录

24小时记录一次数据，连续5天。

10、实验结果

三、腐乳中酵母含量的检测

1、实验材料和设备

研钵1个，100mL量筒1个，滴定管1支，1 mL移液管5支，试管5支，玻璃棒1根，培养皿12个，500mL烧杯一个，涂布器1个，洗耳球1个，药匙1个，试管架1个，酒精灯1盏，电磁炉1个，天平1台，pH试纸，250mL锥形瓶3个，铁架台1个，漏斗1个，标签纸1张，纱布、棉花、线、报纸若干，高压蒸汽灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台。

2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基的配制

配方：马铃薯200g   葡萄糖20g   琼脂15~20g   蒸馏水1000ml      自然pH

步骤：先洗净去皮,再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20—30分钟，能被玻璃棒戳破即可），用纱布过滤，加热，再据实际实验需要加琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000ml，分装锥形瓶，加塞、包扎，（121℃）灭菌20分钟左右后取出。

3、4、5跟细菌含量的检测步骤一样

6、接种

据样品污染估计，选择3 个适宜稀释度的样品匀液，我们选择了10-11、10-12、10-13三个稀释度，进行10倍稀释时，吸取0.5 mL 样品匀液于无菌培养皿内，每个稀释度做了3个平皿。同时，留1个培养皿作空白对照。（注：每个稀释度做三个培养皿是为了降低误差，使结果更准确）

7、渗透

    将接种后的培养皿放置30min，使样液渗入培养基。

8 、倒置培养

 将渗透好了的培养基翻过来，放在温度为28±1℃ 的恒温箱中培养5天。

9、观察计数

24小时记录一次数据，连续记录5天。

10、实验结果

四、腐乳中大肠菌群有无的检测

1、实验材料和设备

研钵1个，100mL量筒1个，滴定管1支，1 mL移液管5支，试管5支，玻璃棒1根，500mL烧杯一个，培养皿13个，涂布器1个，洗耳球1个，药匙1个，酒精灯1盏，试管架1个，电磁炉1个，天平1台，pH试纸，250mL锥形瓶3个，标签纸1张，纱布、棉花、线、报纸若干，高压蒸汽灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台。

2、实验流程

3、乳糖胆盐发酵管的配制

配方：蛋白胨20g   乳糖10g   猪胆盐5g  0.04%溴甲酚紫水溶液25mL   蒸馏水1000mL  pH7.4

制法：将蛋白胨、乳糖及猪胆盐溶于水中，校正pH，加入指示剂，然后往每支试管中加10ml左右的乳糖发酵液，再放入1支杜氏小管，我们组共装了4支，最后，加塞、包扎放入高压蒸汽锅115℃灭菌15min。

4、接种

将灭完菌的乳糖胆盐发酵管放到无菌室内冷却降温，等温度降到室温时，用移液管吸取0.5ml样液于乳糖胆盐发酵管中，然后混匀加塞。

5、培养

     将接完菌的乳糖胆盐发酵管放在37℃的恒温箱中培养，时间为24小时。

6、观察

我们的乳糖胆盐发酵管中的杜氏小管没有浮起来，说明市售腐乳中没有大肠菌群。

4.思考题

（1） 用滤膜法检测大肠菌群有什么优点？

答：滤膜法的优点:⑴与直接法比较可以检测大量的样品。 ⑵浓缩效应使微生物的检测结果提高。 ⑶带有菌落的滤膜可作为检测的永久记录存档。 ⑷可见的菌落与样品量直接对应，得出定量结果。

（2）检查样品中的大肠菌群有何意义？

答：大肠菌群主要包括肠杆菌科中的埃希氏菌属、柠檬酸细菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。这些属的细菌均来自于人和温血动物的肠道，需氧与兼性厌氧。不形成芽泡，在35—39℃条件下，48h内能发酵乳糖产酸产气，革兰氏阴性。大肠菌群中以埃希氏菌属为主，埃希氏菌属被俗称为典型大肠杆菌。大肠菌群都是直接或间接地来自人和温血动物的粪便。本群中典型大肠杆菌以外的菌属，除直接来自粪便外，也可能来自典型大肠杆菌排出体外7—30 d后在环境中的变异。所以食品中检出大肠茵群，表示食品受到人和温血动物的粪使污染，其中典型大肠杆菌为粪便近期污染，其他菌属则可能为粪便的陈旧日污染。大肠菌群最初作为肠道致病菌而被用于水质检验，现已被我国和国外许多国家广泛用做食品卫生质量检验的指示菌。大肠菌群的食品卫生学意义是作为食品被粪便污染的指示菌，食品中粪便含量只要达到10-3mg/kg即可检出大肠菌群。

 肠道致病菌如沙门氏菌属和志贺氏菌属是引起食物中毒的重要致病菌、然而对食品经常进行逐批逐件地检验又不可能，鉴于大肠茵群与肠道致病菌来源相同，而且一般在外环境中生存时间也与主要肠道病原茵一致，所以大肠茵群的另一个重要食品卫生学意义是作为肠道病原菌污染食品的指示菌。当然食品中检出大肠菌群，只能说明有肠道病原茵存在的可能性，两者并非一定平行存在，但只要食品中检出大肠菌群，则说明有粪便污染，即使无病原菌．该食品仍可被认为是不卫生的。

5.实验心得

   这次实验还算圆满成功，在实验过程中我们遇到很多的问题，我们没有能够很好及时的处理，还有一些注意事项我们没有意识到，所以在以后的实验中要做好各种准备，不能手忙脚乱，我们要认真对待实验，不能马虎，在以后的试验中遇到不懂的要你那够自己很好的处理，还有一些细节我们要注意，比如稀释的时候各种小细节都直接影响实验的结果。我们不足的地方需要不断的改进，在以后的实验学习难免遇到，所以一定要养成严谨的好习惯。、在实验过程中，我们要注意灭菌和无菌操作的重要性，尽量避免杂菌污染，导致实验误差每次实验结束时，都需要整理好自己所负责的台面卫生，确保实验室的安全整洁。搞好实验室的卫生。养成好习惯。这次的微生物课程实习，让我学到了很多，比如说怎样设计实验方案以及团队精神的重要性，而且，这次的课程实习，让我对自己的实验动手能力有了一个新的认识和提高，能更深刻的认识到自己实验过程中不足的一方面，在以后的学习中一定注意这方面的培养重视！认真对待实验。总之这次试验不仅让我学习到了知识，还学习到了怎么和自己的团队一起完成一项任务，怎样在一起合作。总之收货很大。

 

第二篇：微生物自主实验报告

微生物自主实验报告

涂平板分离土壤中的微生物，选用的菌株

显微镜下观察的细菌形态

芽孢染色、革兰氏染色

细菌的生理生化反应

Ø  酚红半固体（左为亮黄的实验结果、右为乳白的实验结果）

Ø  糖酵解

实验菌：亮黄

（培养基从左至右依次为：乳糖、蔗糖、葡萄糖）

实验菌：乳白

（培养基从左至右依次为：葡萄糖、蔗糖、乳糖，其中有封口膜的为实验组，无封口膜的为对照组）

细菌总DNA提取、凝胶电泳检测

实验原理：

DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物后，必须将其中蛋白质去除。实验中，溶酶菌可以破坏细菌的细胞壁，10%SDS可以破坏细菌细胞膜，氯仿：异戊醇可以使蛋白质变性，最后用乙醇沉淀DNA。 

DNA的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于DNA分子或DNA片断的分子量差别，电泳后呈现迁移位置的差异。

实验材料和方法：

材料：

1、菌种

      E. coli

2、试剂

      TE

      溶菌酶溶液（0.15mol/l Nacl, 0.1mol/l Na2EDTA, 15mg/ml溶菌酶，pH=8）

      10% SDS （0.1mol/l Nacl，0.5mol/l Tris，10%SDS，pH=8）

      酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)

      乙醇

3. 仪器

     高速台式离心机、紫外检测仪

4. 其他材料：离心管、无菌吸头 、移液器等

实验方法：

（一）革兰氏阴性菌总DNA提取方法 (本实验所用菌株经革兰氏染色呈阴性)

  1. 0.9ml 细菌培养液, 6000rpm离心2分钟, 弃上清,

     加0.9ml溶菌酶溶液悬混.

  2.  37℃温浴20 min

  3.  加0.9ml 10%SDS，反复颠倒混匀5 min，10000r/min离心10min，取上清，分至两管（~0.7ml）

  4.  加等体积苯酚：氯仿：异戊醇，混匀5 min，水相移至新管

  5.  加40μl的3mol/l乙酸钠和3ml无水乙醇，-20℃沉淀DNA10 min，12000r/min 离心10min，弃上清

  6.   轻轻加70%乙醇，置2min，弃乙醇，静置待乙醇挥发干净（~20 min）

  7.  加100μl TE溶解DNA

（二）DNA的琼脂糖凝胶电泳

  1、1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀，微波炉加热溶解。

2、将冷却至50℃的凝胶倒入制胶室，插入梳子，室温冷却凝固

3、将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子

4、用移液器吸取总DNA 4μl于封口膜上，再加入1μl 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔

5、打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min

6、电泳结束后取出凝胶，置EB 溶液中染色5~10min，清水漂洗

7、将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带

实验结果：

我们的实验组为4、5、6，其中第四、五组的荧光效果较强，说明DNA浓度足够大。

分析讨论：

本实验提取到的总DNA通过电泳分析证明DNA含量水平合适，可以用于PCR实验。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带 。

实验菌是革兰氏阴性菌，其细胞壁薄、肽聚糖含量低。经过溶菌酶处理后，肽聚糖的1，4-糖苷键断裂，细胞壁裂开，同时经过阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体的充分的裂解。在有机溶剂（酚、氯仿）存在时，核酸结合蛋白会发生变性，从核酸分子上解离下来，而由于核酸分子携带有大量负电荷，极性较强，当体系分相时会保留在水相中。在实验过程中，由于细菌裂解后受到剪切力或核酸降解酶的作用，染色体DNA容易被切断成为各种大小不同的碎片而与质粒DNA共同存在，因此，采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有质粒DNA外，还可能有少部分染色体DNA和RNA，经过电泳扩散后，RNA的扩散速度比较快，故会出现在条带最前端，总DNA由于扩散速度慢，离点样孔较近的地方分布较多。 

本次试验中，要注意离心管不可剧烈震动，防止过多断裂，在用移液器吸取DNA溶液时，也可以将枪头稍微用剪刀剪大一些，保护DNA防止其断裂；同时，加入有机溶剂分层后，要注意吸取上层水层。