实验实训九 微生物接种技术

一、 实验实训目的

学习微生物工作的基本接种方法，建立纯培养技术中的“无菌“概念”，掌握无菌操作技术。

二、 实验实训材料

1．菌种 葡萄球菌、大肠杆菌斜面菌种。

2．器材 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（斜面、液体、柱状、平板等），接种环（针），酒精灯，酒精棉球。

三、 实验实训内容及方法

（一） 常用的几种工具（实图9-1）。

（二） 无菌操作

菌种分离或移接工作应在无菌环境中进行，接种室、接种箱或超净工作台是常用的接种环境。用前先清洁好卫生，再进行消毒处理。可用紫外线灯和甲醛熏蒸的双重作用，或用3%来苏尔及其他表面消毒进行喷雾。

操作者的手应先用肥皂洗净，再用酒精棉球消毒；整个操作过程都要靠近酒精灯火焰；接种工具在用前和用后必须在灯焰上灭菌；棉塞不得乱放，操作中只能夹在手上；不能有跑、跳等力度大的动作，以免引起空气大振动而增加染菌机会。

（三）接种方法

1．斜面接种法 把各种培养条件下的菌种，接入斜面上（包括从试管斜面、培养基平板、液体纯培养物等中把菌种移接于斜面培养基上）。这是微生物学中最常用、最基本的技术之一。接种前，需在待接种试管上贴好标签，注明菌名及接种日期。接种最好在无菌室或无菌箱内进行，若无此条件，可在较清洁密闭的室内进行。室内应事先消毒，桌面要清洁，除去灰尘和杂物，用5%来苏儿溶液擦洗桌面。斜面菌种移接的基本操作方法及注意事项见实图（9-2）。

（1）点燃酒精灯，灯焰周围约1～2cm处的空间为无菌区，所以在酒精灯灯焰旁进行无菌操作法接种，可避免杂菌污染。

（2）将菌种及接种用的斜面培养基（即两支斜面试管）同时握在左手中，使中指位于两试管之间。管内斜面向上，两试管管口相互平行，两支试管处于接近水平位置，用右手的小指、无名指及手掌在火焰旁同时拔去两支试管的棉塞，并使管口在火焰上通过，以烧死试管口的杂菌。随后把管口移至火焰近旁约1-2cm处。

（3）右手拿接种环，先垂直、后水平方向把接种环放在火焰上灼烧。凡是需进入试管的杆部分均应通过火焰灼烧，下端的环心须烧红，以彻底灭菌。灼烧时，应把环放在酒精灯之外焰（氧化焰）上，因外焰温度高，易于烧红。

（4）将烧过的接种环伸入菌种管内，先使环接触斜面上端的培养基或试管壁，使接种环充分冷却，待培养基不再被接种环融化时，即可将接种环伸向斜面中部蘸取少量菌体，然后小心地将接种环从试管内抽出。注意不能让环接触管壁和管口。取出后，接种环不能通过火焰，在火焰旁抽出并迅速伸入新培养基斜面管内，在斜面下1/5处，由下至上轻轻划线。注意不要把培养基划破，也不要把菌沾在管壁上。此过程要迅速、准确完成。

（5）接种完毕，试管口必须迅速通过火焰灭菌，在火焰旁塞入棉塞。注意

不要使试管离开火焰去迎棉塞，以免进入带菌空气。操作中如不慎使棉塞着火，要迅速塞入试管内，由于缺氧火自然就会熄灭。若棉塞 外端仍然着火，也不要用嘴吹，迅速用手捏几下棉塞，即可熄灭。

（6）划线完毕，接种环要灼烧灭菌，才能放回原处，以免污染环境。放回接种环后，再进一步把试管的棉塞塞紧。置28℃下培养2-3d，进观察

2．液体接种

液体接种是一种用移液管、滴管或接种环等工具将菌液移接到培养基中的方法。吸管不同于其它接种工具，不能灼烧，可预先对其进行烘烤法灭菌。

3．穿刺接种

穿刺接种常用于保藏菌种或细菌运动性的检查。一般适用于细菌、酵母菌的接种培养。用接种针沾取少许菌种，移入装有固体或半固体培养基的试管中，自培养基中心垂直刺入到底，然后按原来的穿刺线将针慢慢拔出。

四、 实验实训报告

记录几种接种操作的结果。

五、 思考题

1．何谓无菌操作？接种前应作哪些准备工作？

2．总结几种接种方法的要点及应注意的事项？

 

第二篇：微生物制药技术

微生物制药技术

工业微生物技术是可持续发展的一个重要支撑，是解决资源危机、生态环境危机和改造传统产业的根本技术依托。工业微生物的发展使现代生物技术渗透到包括医药、农业、能源、化工、环保等几乎所有的工业领域，并扮演着重要角色。欧美日等国已不同程度地制定了今后几十年内用生物过程取代化学过程的战略计划，可以看出工业微生物技术在未来社会发展过程中重要地位。

微生物制药技术是工业微生物技术的最主要组成部分。微生物药物的利用是从人们熟知的抗生素开始的，抗生素一般定义为：是一种在低浓度下有选择地抑制或影响其他生物机能的微生物产物及其衍生物。(有人曾建议将动植物来源的具有同样生理活性的这类物质如鱼素、蒜素、黄连素等也归于抗生素的范畴，但多数学者认为传统概念的抗生素仍应只限于微生物的次级代谢产物。)近年来，由于基础生命科学的发展和各种新的生物技术的应用，报道的微生物产生的除了抗感染、抗肿瘤以外的其他生物活性物质日益增多，如特异性的酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂和抗氧化剂等，其活性已超出了抑制某些微生物生命活动的范围。但这些物质均为微生物次级代谢产物，其在生物合成机制、筛选研究程序及生产工艺等方面和抗生素都有共同的特点，但把它们通称为抗生素显然是不恰当的，于是不少学者就把微生物产生的这些具有生理活性（或称药理活性）的次级代谢产物统称为微生物药物。微生物药物的生产技术就是微生物制药技术。可以认为包括五个方面的内容：

第一方面 菌种的获得

根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。

分离思路 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。具体分离操作从以下几个方面展开。

定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。

采样：有针对性地采集样品。

增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。

分离：利用分离技术得到纯种。

发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。

第二方面 高产菌株的选育

工业上生产用菌株都是经过选育过的。工业菌种的育种是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。

工业菌种育种的方法：诱变、基因转移、基因重组。

育种过程包括下列3个步骤： (1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的选出。(3)改良菌种的评价(包括实验规模和工业生产规模)。

选择育种方法时需综合考虑的因素(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(例如分批或者连续发酵试验)；(2)对这一特定菌种的遗传和生物化学方面认识的明了程度；(3)经济费用。如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术；如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。

工业菌种具体改良思路：(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤（通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。） (2)增加前体物的浓度。

(3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。(4)抑制或消除产品分解酶。 (5)改进菌种外泌产品的能力。(6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的结构类似物抗性。 第三部分 菌种保藏技术

转接培养或斜面传代保藏；

超低温或在液氮中冷冻保藏；

土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。

第四部分 发酵工艺条件的确定

微生物的营养来源

能源，自养菌：光；氢，硫胺；亚硝酸盐，亚铁盐。异养菌：碳水化合物等有机物，石油天然气和石油化工产品，如醋酸。

碳源，碳酸气；淀粉水解糖，糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等，石油、正构石蜡，天然气，醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品

氮源，豆饼或蚕蛹水解液，味精废液，玉米浆，酒糟水等有机氮，尿素，硫酸铵，氨水，硝酸盐等无机氮，气态氮

无机盐，磷酸盐，钾盐，镁盐，钙盐等其他矿盐，铁、锰、钴等微量元素等 特殊生长因子，硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌醇等

培养基的确定

（1）首先必须做好调查研究工作，了解菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求。工业生产主要应用细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类微生物。它们对营养的要求既有共性，也有各自的特性，应根据不同类型微生物的生理特性考虑培养基的组成。

（2）其次，对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构、一般提取方法和产品质量要求等也需要有所了解，以便在选择培养基时做到心中有数。

（3）最好先选择一种较好的化学合成培养基做基础，开始时先做一些摇瓶实验;然后进一步做小型发酵罐培养，摸索菌种对各种主要碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物的能力。注意培养过程中的pH变化，观察适合于菌种生长繁殖和适合于代谢产物形成的两种不同pH，不断调整配比来适应上述各种情况。

（4）注意每次只限一个变动条件。有了初步结果以后，先确定一个培养基配比。 其次再确定各种重要的金属和非金属离子对发酵的影响，即对各种无机元素的营养要求，试验其最高、最低和最适用量。在合成培养基上得出一定结果后，再做复合培养基试验。最后试验各种发酵条件和培养基的关系。培养基内pH可由添加碳酸钙来调节，其他如硝酸钠、硫酸铵也可用来调节。

（5）有些发酵产物，如抗生素等，除了配制培养基以外，还要通过中间补料法，一面对碳及氮的代谢予以适当的控制，一面间歇添加各种养料和前体类物质，引导发酵走向合成产物的途径。

(6)根据经济效益选择培并基原料

考虑经济节约，尽量少用或不用主粮，努力节约用粮，或以其他原料代粮。糖类是主要的碳源。碳源的代用品主要是寻找植物淀粉、纤维水解物，以废糖蜜代替淀粉、糊精和葡萄糖，以工业葡萄糖代替食用葡萄糖；石油作为碳源的微生物发酵也可以生产以粮食为碳源的发酵产品。有机氮源的节约和代替主要为减少或代替黄豆饼粉、花生饼粉、食用蛋白胨和酵母粉等含有丰富蛋白质的原料为目标，代用的原料可以是棉籽饼粉、玉米浆、蚕蛹粉、杂鱼粉、黄浆水或麸汁、饲料酵母、石油酵母、骨胶、菌体、酒糟，以及各种食品工业下脚料等。这些代用品大多蛋白质含量丰富，价格低廉，便于就地取材，方便运输。

培养工艺的确定：

培养条件：温度、pH值、氧、种龄、接种量、温度

工业微生物的培养法分为静置培养和通气培养两大类型。

静置培养法即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行发酵，又称为厌氧性发酵。通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称为好气性发酵。

在静置和通气培养两类方法中又可分为液体培养和固体培养两大类型，其中每一类型又有表面培养与深层培养之分。

关于液体深层培养：

用液体深层发酵罐从罐底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来讲，称为深层培养法。特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。

深层培养基本操作的3个控制点

①灭菌：发酵工业要求纯培养，因此在发酵开始前必须对培养基进行加热灭菌。所以发酵罐具有蒸汽夹套，以便将培养基和发酵罐进行加热灭菌，或者将培养基由连续加热灭菌器灭菌，并连续地输送于发酵罐内。②温度控制：培养基灭菌后，冷却至培养温度进行发酵，由于随着微生物的增殖和发酵会发热、搅拌产热等，所以为维持温度恒定，须在夹套中以冷却水循环流过。 ③通气、搅拌：空气进入发酵罐前先经空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进人，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。为了延长气泡滞留时间，可在罐内装挡板产生涡流。搅拌的目的除了溶解氧之外，可使培养液中微生物均匀地分散在发酵罐内，促进热传递，以及为调节pH而使加入的酸和碱均匀分散等。

第五部分 发酵产物的分离提取

提取方法：

过滤

离心与沉降

细胞破碎

萃取

吸附与离子交换

色谱分离

沉析（盐析、有机溶剂沉析、等电点等）

膜分离

结晶

干燥

分离提取过程的几个注意的问题：

水质

热源去除（石棉板吸滤、活性碳吸附、过离子交换柱） 溶剂回收

废物处理

生物安全性

20xx/09