实 习 报 告

邵  阳  学  院

20##年12月10日

一、实验时间与地点

时间： 20##年下学期第13--15周

地点：邵阳学院李子园校区生物与化学工程系微生物实验室

二、实习过程概述

11.18下午在2栋教学楼204室举行动员大会

11.18至12.19查找资料并设计实验方案。

11.20上午提交实验方案并通过了，下午再去领实验器材，清洗实验器材，烘干，包扎。

11.21 配制牛肉膏蛋白胨培养基，做无菌检查

11.22 样品中细菌的检测进行十倍稀释、接种

11.23 细菌菌落的观察及计数

11.24 配制察氏培养基，做无菌检查

11.25 样品中酵母菌的检测进行十倍稀释、接种

11.26—11.28 观察酵母菌落及计数

11.29 配制察氏培养基，做无菌检查

11.30样品中霉菌的检测进行十倍稀释、接种

12.01--12.05观察霉菌菌落及计数

12.06 配制乳糖发酵培养基，做产气实验

12.07 观察产气情况

12.08—12.10数据的处理分析，完成实习报告。

三、实习内容

（一）香干中细菌含量的测定：

Ⅰ、实验材料

（1）、实验器材及试剂

设备:电热恒温培养箱37℃±1℃、电磁炉、电子天平、PH试纸、吸管1ml、10ml 6个、烧杯（1000ml）一个、三角瓶（500ml、250ml）各一个、培养皿（直径90mm）9个、试管9个、试管架、酒精灯、研钵、剪刀、灭菌镊子、75%酒精棉球、量筒（500ml）、玻棒、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布

试剂：75%乙醇、生理盐水、1mol/L氢氧化钠溶液

（2）、牛肉膏蛋白胨培养基

配方：牛肉膏 3g、蛋白胨 10g、 NaCl 5g、琼脂 15—20g、无菌水 1000ml、pH 7.4—7.6
    配置步骤：

① 称量

② 溶化

    ③ 调pH

④ 分装

    ⑤ 加塞

    ⑥ 包扎

⑦ 灭菌

⑧ 倒平板

（3）、检样稀释及培养

① 以无菌操作，将检样豆干25g剪碎、研磨以后，放于盛有225ml无菌水的三角瓶内，并在三角瓶中放入玻璃珠，经充分振摇做成1：10的均匀稀释液。

② 用1ml无菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁缓慢注入含有9ml无菌水的无菌试管内，振摇试管混合均匀，做成1：100的匀液。

③ 另取1ml的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。

④ 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移0.3ml稀释液于无菌培养皿内，每个稀释度作三个培养皿。同时做好空白对照组。

⑤ 稀释液移入培养皿后，应及时用涂布器在培养基表面将样品均匀涂布。

⑥ 等琼脂凝固后，翻转培养皿，置（36±1）℃恒温箱内培养24h取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得1g样品所含菌落总数。

Ⅱ、菌落计算方法

（1）菌落计数方法

     做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。

（2）菌落计数的报告

① 平板菌落数的选择

选取菌落数在30～100之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用三个平板，应采用三个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线），若仅有一条链，可视为一个菌落数；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。

② 稀释度的选择

 应选择平均菌落数在30～100之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。若所有稀释度平均菌落数均大于100，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

  若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

  若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。

若所有稀释度的平均菌落数均不在30～100之间，其中一部分大于100或小于30时，则以最接近30或100的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

（3）、实验具体流程如下

（4）、下表为实验时记录的豆干中细菌的含量数据：

样品中细菌的含量

注：每个平板加入0.3ml的稀释液

其中，细菌菌落全为白色。

（二）豆干中酵母菌含量检测

Ⅰ、实验材料

（1）、实验器材及试剂

设备：恒温培养箱、电子天平、锥形瓶容量（ 500 mL、250 mL ）各一个、无菌吸管1 mL、10 mL 6个、无菌培养皿9个、无菌试管20个、试管架、酒精灯、研钵、剪刀、灭菌镊子、75%酒精棉球、牛皮纸袋、塑料

试剂：蔗糖3g、NaN03 0.3g、 K2HP04 0.1g、KCl 0.05g、MgSO4·7H2O 0.05 g、FeS04 0.001 g、琼脂1.5-2g、无菌水1000ml 

（2）察氏培养基

配方：蔗糖30g、NaN03 3g、 K2HP04 0.1g、KCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeS04 0.01 g、琼脂15-20g、无菌水1000ml、自然pH                                                    

配制步骤：

① 称量及溶化  量取所需水量约2／3左右加入到烧杯中，分别称取蔗糖、NaNO3 、K2HP04 、KCl、MgSO4。依次逐一加入水中溶解。按每100 ml培养基加入1ml 0.1％的FeS04溶液。  

② 定容  待药品全部溶解后，将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。  

③ 加琼脂  加入所需量琼脂，加热融化，补足失水。  

④ 分装、加塞、包扎。  

⑤ 高压蒸汽灭菌 0.103 MPa，121°C灭菌20 min。

⑥ 倒平板

Ⅱ、操作步骤

（1）、样品的稀释

① 样品预处理：以无菌操作，将检样香干25g剪碎、研磨以后，放于盛有225ml无菌水的三角瓶内，经充分振摇做成1：10的均匀稀释液。

② 取1 mL 1:10稀释液注入含有9 mL无菌水的试管中, 另换一支1 mL无菌吸管反复吹吸,此液为1:100 稀释液。

③ 按上步操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1次 1 mL 无菌吸管。 

④ 根据对样品污染状况的估计，选择3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行 10 倍递增稀释的同时， 每个稀释度分别吸取0.3 mL 样品匀液于 3 个无菌平皿内。 同时作好空白对照。

⑤ 稀释液移入培养皿后，应及时用涂布器在培养基表面将样品均匀涂布。

⑥ 等琼脂凝固后，翻转培养皿，置（28±1）℃恒温箱内培养3—5天取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得1g样品所含菌落总数。

Ⅲ、结果与报告

（1）、计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。

① 若所有平板上菌落数均大于 150 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

② 若所有平板上菌落数均小于 10 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

③ 若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于 1计数。

（2）、报告

① 菌落数在 100 以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。

② 菌落数大于或等于 100 时，前 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2 位数字，后面用0 代替位数来表示结果；也可用 10 的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。

③ 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告，报告酵母数。

实验具体流程如下：

下表为实验时记录的香干中酵母菌的含量数据：

样品中酵母菌的含量

注：每个平板加入0.3ml的稀释液

酵母菌菌落呈白色，且表面很潮湿。

（三）豆干中霉菌霉菌含量检测

Ⅰ、实验材料

（1）、实验器材及试剂

设备：恒温培养箱、电子天平、锥形瓶容量（ 500 mL、250 mL ）各一个、无菌吸管1 mL、10 mL 6个、无菌培养皿9个、无菌试管20个、试管架、酒精灯、研钵、剪刀、灭菌镊子、75%酒精棉球、牛皮纸袋、塑料

试剂：蔗糖30g、NaN03 3g、 K2HP04 1g、KCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeS04 0.01 g、琼脂15-20g、无菌水1000ml 

（2）察氏培养基

配方：蔗糖30g、NaN03 3g、 K2HP04  1g、KCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeS04 0.01 g、琼脂15-20g、无菌水1000ml、自然pH                                                   

配制步骤：

① 称量及溶化  量取所需水量约2／3左右加入到烧杯中，分别称取蔗糖、NaNO3 、K2HP04 、KCl、MgSO4。依次逐一加入水中溶解。按每1000 ml培养基加入10ml 0.1％的FeS04溶液。  

② 定容  待药品全部溶解后，将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。  

③ 加琼脂  加入所需量琼脂，加热融化，补足失水。  

④ 分装、加塞、包扎。  

⑤ 高压蒸汽灭菌 0.103 MPa，121°C灭菌20 min。

⑥ 倒平板

（3）、检样稀释及培养

① 以无菌操作，将检样香干25g剪碎、研磨以后，放于盛有225ml无菌水的三角瓶内，并在三角瓶中放入玻璃珠，经充分振摇做成1：10的均匀稀释液。

② 用1ml无菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁缓慢注入含有9ml无菌水的无菌试管内，振摇试管混合均匀，做成1：100的匀液。

③ 另取1ml的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。

④ 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移0.3 ml稀释液于无菌培养皿内，每个稀释度作三个培养皿。同时做好空白对照组。

⑤ 稀释液移入培养皿后，应及时用涂布器在培养基表面将样品均匀涂布。

⑥ 等琼脂凝固后，翻转培养皿，置（28±1）℃恒温箱内培养5—7天取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得1g样品所含菌落总数。

实验具体流程如下：

下表为实验时记录的豆干中霉菌的含量数据：

样品中霉菌的含量

注：每个平板加入0.3 ml的稀释液

霉菌菌落有菌丝，菌落较大，有白色、黄色、黑色的菌落。

（四）、香干中大肠杆菌的检测

大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。

食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。

Ⅰ、实验材料

（1）、实验器材及试剂

设备：恒温箱（36±1℃）、电子天平、乳钵、试管 20个、吸管（1 mL、10 mL）6个、三角烧瓶（500ml、250ml）各一个、酒精灯、试管架、烧杯（1000ml）一个、杜氏小管

试剂：结晶紫1克、95％乙醇20ml、1％草酸铵水溶液 80ml、0.85％灭菌生理盐水、磷酸二氢钾34g 、1mol/L氢氧化钠175ml、无菌水5000ml、蛋白胨30g、乳糖25g、2％ 伊红水溶液 20ml、0.5％美蓝水溶液 13ml、胰蛋白胨20g、3号胆盐 1.5g、磷酸氢二钾 2g、氯化钠100g、琼脂20g、0.65％美蓝溶液10ml、0.04％溴甲酚紫水溶液25ml、猪胆盐 5g、0.4％溴甲酚紫水溶液 2.5ml

Ⅱ、操作步骤

（1）、检样稀释

以无菌操作将检样25 g放于有225mL无菌水的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠),经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。

（2）乳糖发酵试验

分别取 1ml 1:10的均匀稀释液于9个乳糖胆盐发酵管内，置36±1℃ 温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。

（3）、分离培养

将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃ 温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。

（4）、证实试验

在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置 36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。

（5）、报告

根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。

实验具体流程如下：

 

Ⅲ、结果报告

乳糖胆盐发酵管现象

4只试管都不产生气泡（注:每只试管加入1ml稀释液，产气的现象为杜氏小管中有气泡产生。）

试验结论：香干中无大肠杆菌群

四、实验经验与心得总结

（一）、实习体会

1.团队的重要性，一个人是不可能在三星期内完成实习内容的，必须在多人共同努力下才能完整的完成实验，才能很好的完成实验。

2.实验前必须有详细的实习计划书，熟话说的好，万事开头难，好的开始是成功的一半。制定详细的计划书可以很好的帮助我们后面实验的过程，为我们节约了很多时间。合理的规划了我们的时间.

3.实验前资料查阅的重要性，没有好的指导，就不可能做出好的结果。只有明确了我们需要做什么，我们需要什么样的培养基，什么样的试剂以及仪器。只有在准备充分的前提下才能有条不紊的进行试验。

4.组长的重要性，如果狼群没有狼王，那就没有任何威慑力。组长合理的分配了各个组员的任务，使大家分工明确，知道该做什么，要做什么，这样就不会出现有组员打酱油的情况发生，也不会让组员感觉无聊。让大家都参与进来，为实验做自己的一点贡献，做出实验成果时，都能有一定的收获。一分耕耘，一分收获。组长还可以协调组员有时发生的矛盾。

5.自己动手的重要性。看着别人做，好像很简单的样子，可是当自己做的时候就不是那么回事了，没有想象中的简单。实践出真知。

6.不要怕失败，没做实验前感觉实验还挺简单的，安排那么多时间，纯粹是浪费。后来自己做了后才知道，事情并不是想象中的那么简单。不仅耗时，而且耗力。不知道失败了多少次后才做出了实验结果。坚持到最后的都是英雄。

7.做事要有始有终，不能刚开始满腔热情，但是还没开始一半就半途而废了。微生物实验不要想做一次就能成功的。一般是要多次才能成功。所以要坚持做完。

8.操作一定要标准，微生物实验室一项精密的实验，稍微有点疏忽或者操作不当，可能实验就报废了，得重新来过。

9.细节的重要性，细节决定成败。每次试验完后，实验桌一定要整理干净，实验药品一定要放回原处，以方便下次做实验以及另外组做实验

（二）、试验中存在的不足与建议：

 1、实验室的样品试剂需好好保存，每次用完后都需盖好放回原处好好保存，防止变质。

2、样品在研磨时，要研磨充分。

3、在做细菌的实验时，我们组做了两次，第一次是因为涂布器没有完全冷却就涂布，导致细菌被烫死，实验没有现象。

4、在做大肠菌群的测定时，杜氏小管需用注射器注满培养基，再倒置后缓缓放入试管中，切忌不可垂直丢入，这样很可能会导致试管破裂，杜氏小管注射培养基时，需注满，不然，放入试管后会导致小管内出现气泡，影响实验结果！

总的来说，这次的微生物课程实习，让我学到了很多，比如怎样设计实验方案、团队合作精神的重要性以及操作时操作技术日渐成熟等等。而且，这次的课程实习，让我对自己的实验动手能力有了一个新的认识和提高，能更深刻的认识到自己实验过程中不足的一方面，意识到自己的理论知识还不够扎实，动手能力还不够成熟。让自己在日后的学习中能更好地运用操作实验，对自己日后的发展打下了坚实的基础

五、课后思考题

1、用滤膜法检测大肠菌群有什么优点？

答：（1）与直接法比较可以检测大量的样品。

（2）浓缩效应使微生物的检测结果提高。

（3）带有菌落的滤膜可作为检测的永久记录存档。

（4）可见的菌落与样品量直接对应，得出定量结果。

2、检查豆制品中的大肠菌群有何意义？

答：主要是以该菌群的检出情况来表示豆制品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。