第一章 绪论
一、生物技术的发展简史
答:以技术特征来分可分为:传统生物技术,近代生物技术,现代生物技术
1、传统生物技术阶段
远古人们对微生物的利用,酿造技术
1680年发现了微生物、揭示了发酵现象的奥秘
19世纪末,20世纪30年代出现了工业发酵、开创了工业微生物的新时期
特点:生产过程简单、生产设备要求低、产品多为结构简单的初级代谢产物
2、近代生物技术阶段
19xx年,开发研究青霉素
抗生素工业
氨基酸发酵工业 20世纪50年代
酶制剂工业 20世纪60年代
特点 :产品类型多、生产技术要求高、生产设备规模巨大、技术发展速度快。
3、现代生物技术阶段
19xx年watson ,crick.提出生命基本物质DNA双螺旋结构模型
19xx年Boyer和Cohen建立了DNA重组技术
19xx年,杂交瘤技术(抗体工程)
19xx年,基因操作手段获得生长激素抑制因子。胰岛素等克隆。
19xx年基因工程产品被投放市场。
20xx年人类基因组草图完成
特点:(1)基因操作技术日新月异(2)新技术新方法迅速应用(3)基因工程药物和疫苗研究开发快(4)新的生物治疗制剂产业化前景光明(5)转基因动、植物取得重大突破(6)现代生物技术给农业、畜牧业带来飞跃(7)重要基因的结构和功能研究是今后的研究热点(8)基因治疗取得了大的进展(9)蛋白质工程的发展(10)生物信息学的发展
二、生物技术药物的分类
答:1.生物技术制药:采用现代生物技术、借助某些微生物、植物或动物来生产所需要的药品。
2.生物技术药物:采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。
3.生物药物:泛指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物或生物体的某一组成部分,甚至整个生物体用作诊断和治疗疾病的医药品。
4.生物药物的分类(1)应用重组DNA技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗药物(2)基因药物(3)动物、植物和微生物的天然药物(4)合成和部分合成的生物药物。
按功能分类(1)治疗药物(2)预防药物(3)诊断药物。
三、生物技术制药的特征:高技术,高投入,长周期,高风险,高收益。
四、利用基因工程技术生产的两个不同途径:1.用克隆的基因表达生产有用的肽类和蛋白质药物或疫苗。2.利用基因工程技术改造传统的制药工业。
第二章 基因工程制药
一、基因工程新药:免疫性蛋白,细胞因子,激素,酶类。
二、基因工程技术生产药品的优点(简答):
1.利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽(胰岛素,干扰素,细胞因子等)。
2.可以提供足够数量的生理活性物质,以便对其生理、生化和机构进行深入的研究,从而扩大这些物质的应用范围。
3.利用基因工程可以发现挖掘更多的内源性生理活性物质。
4.可以弥补内源生理活性物质药物的不足,并对其进行改造。
5.利用基因工程技术可获得新型化合物,扩大药物筛选来源。
三、目的基因的获得
原核细胞(较易获得目的基因)基因组较小,可直接分离获得。
基因组→限制性内切酶→水解成若干片段→探针筛选→提纯→扩增
真核生物:一个单拷贝基因仅占整个基因组的10 甚至更少,不易获得。
构建cDNA文库→构建基因文库→人工合成→PCR扩增
DNA文库:通过重组、克隆保存在宿主细胞中的各种DNA分子的集合体。文库保存了该种生物的全部遗传信息,需要时可从中分离获得。
如何构建DNA文库:
1.分离纯化基因组DNA。条件应温和,以保证得到较长的DNA链。
2.DNA片段与载体连接。基因组DNA→酶水解→具一定长度的片段(粘性末端)
载体(噬菌体等)→酶解→与目的基因连接
3.导入宿主细胞:携带基因组DNA片段的噬菌体或粘粒经包装后转入宿主细胞内培养扩增。插入基因组片段的集合体即基因组文库。
4.筛选目的基因:原核细胞不可用来作为基因的表达系统(无转录后加工)。原核细胞基因库只能用核算探针杂交筛选目的基因。
cDNA文库:以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。利用某种生物的总mRNA合成cDNA,再将这些cDNA与载体连接,转入细菌细胞中进行保存和扩增,称cDNA文库。
特点:(1)不含内含子序列。(2)可以在细菌中直接表达。(3)包含了所有编码蛋白质的基因。(4)比DNA文库小的多,容易构建。
如何构建cDNA文库:cDNA以mRNA为模板经逆转录而成,故须选择mRNA丰富、较易获得的、目的基因表达活跃的组织细胞为材料。
(1)修饰cDNA两端接头:人工合成的双链寡核苷酸,二端均为平头或含酶切位点。衔接头:一端为平头,一端为粘末端。
(2)cDNA与载体相连各cDNA各自与一个载体在T4连接酶作用下以粘末端互相连接,即为重组DNA 分子。
(3)导入宿主细胞 重组体在一定条件下导入宿主细胞培养或保存。宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆体,以保证它们的遗传性状相同。
(4)筛选目的基因 核酸杂交法:cDNA克隆(菌斑或噬菌斑)硝酸纤维素膜→杂交(DNA探针)→显影定位→挑选→培养扩增→纯化。
四、目的基因序列测定法:
1、双脱氧链终止法(Sanger法)
原理:DNA链中的戊糖在3’位碳原子上有-OH基团,在DNA合成、链的延长过程中,新掺入的脱氧核苷酸5’-p与前一核苷酸的戊糖3’-OH以磷酸二酯键相连。
Sanger法是在反应体系中加入 2’, 3’ -ddNTP,由于其没有 3’-OH 而不能与下一个核苷酸相连,于是DNA链的合成便终止。
2、化学裂解法(Maxam-Gilbert法)
原理:使特定的碱基首先被化学修饰,然后再经化学处理。如:用硫酸二甲酯使鸟嘌呤甲基化,然后再加哌啶,使甲基化的鸟嘌呤丢失,DNA链从鸟嘌呤修饰处后的3’,5’-磷酸二酯键断裂。
3、自动测序仪测序法 (ABI)
原理:自动测序仪基于2,3-双脱氧末端终止法的原理,标记系统由放射性核素改为发特定荧光信号的荧光染料,预先将四种荧光染料与四种双脱氧核苷三磷酸共价相连,使其带有不同的荧光标记。当某一种ddNTP掺入到正在合成的DNA单链分子中时,该链的延伸便终止并带有相应的荧光染料。
自动测序系统包括电泳分离系统、荧光检测装置、计算机成像系统及分析软件组合。
其它大片序列测序方法:随机克隆法(先水解再亚克隆)、限制性酶切片段亚克隆法、互套缺失法(定向连续次级克隆)
五、表达载体具备的条件:
1,载体能够独立地复制。
2,应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记。
3,应具有很强的启动子。
4,应具有阻遏子,使启动子受到控制,只有当受到诱导时才能进行转录。
5,应具有很强的终止子,以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因,而不转录其它无关的基因,同时很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。
6,所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号。
六、常用的酵母启动子:
【组成型】:磷酸甘油酸激酶,烯醇酶,3-磷酸甘油醛脱氢酶,乙醇脱氢酶,磷酸三糖异构酶,信息素-因子,细胞色素-c。
【诱导型】:酸性磷酸酯酶,半乳糖激酶,UDP-D-半乳糖-4-差向酶。
七、大肠杆菌表达外源蛋白质的优缺点:
细胞质中:优点:1,形成包涵体。2,蛋白质产量高。3,表达的键简单。
缺点:1,形成包涵体。2,还原环境不利于二硫键的形成。3,N-末端真实性受影响。4,蛋白质酶解。
5,种类分离纯化复杂。
细胞周质:优点:1,由于周质蛋白质种类少,纯化简单。2,蛋白质酶解不甚严重。3,促进二硫键形成与蛋白质
折叠作用。4,蛋白质N-末端结构真实。
缺点:1,信号肽并非总有助于蛋白质转运。2,有可能形成包涵体。
细胞外:优点:1,酶解作用程度低。2,容易纯化。3,促进蛋白质折叠作用。4,蛋白质N-末端结构真实。
缺点:1,大肠杆菌中表达真实的外源蛋白质不会分泌到细胞外。2,分泌在细胞内的稀释,分离纯化相当
复杂。
融合蛋白:真核基因在大肠杆菌中表达时,产生的一种氨基端是原核序列,羧基端是真核序列,由一条短的原核多
肽和真核蛋白结合在一起的蛋白。
八、人胰岛素的生产方法:简答胰组成结构 通过什么方式
九、大肠杆菌表达中遇到的问题:
1,内含子 mRNA 酶系 错误产物。
2,转录信号不同。
3,分子结构。
4,真核蛋白质分离加工。
5,降解。
十、基因工程菌遗传的不稳定性的表现:
1.结构不稳定性:重组DNA分子上某一区域发生缺失,重排,修饰,导致其表观生物学功能的丧失。
2,分配不稳定性:整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸。
十一、基因工程菌的遗传不稳定性的产生机制(导致质粒不稳定性的原因):
1, 受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解。
2, 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢。
3, 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配。
4, 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排。
十二、提高质粒稳定性的方法:
选择合适的宿主菌。选择合适的载体。选择压力。分阶段控制培养。控制培养条件。固定化。
一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性。
十三、基因工程菌的培养方式:
1,分批培养:将种子接入发酵罐中进行培养,经过一段时间后,间歇或连续地补加新鲜培养基,使菌体进一步生
长的培养方法。
2,连续培养:是将种子接入发酵反应器中,搅拌培养至菌体浓度达一定程度后,开动进料和出料蠕动泵,以一定
稀释率进行不间断培养。
3,透析培养:是利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离,其主要目的是通过去除培养液中的代谢产物来解除
其对生产菌的不利影响。
4,固定化培养:基因工程菌经过固定化后,质粒的稳定性大大提高,便于进行连续培养,对分泌型菌更为有利。
十四、培养基常用碳源:葡萄糖,甘油,乳糖,甘露糖,果糖。
氮源:酵母粉,蛋白胨,酪蛋白水解物,玉米浆,氨水,硫酸铵,氯化铵
不同的碳源对菌体生长和外源基因表达有较大影响:使用葡萄糖和甘油菌体比生长速率和呼吸强度相差不大。葡萄糖对lac启动子有抑制作用。用甘露糖做碳源不产生乙酸。乳糖启动子使用乳糖作碳源较为有利,乳糖同时还起诱导作用。
无机磷的影响:过量的无机磷会刺激葡萄糖的利用、菌体生长和氧消耗。在低磷浓度下,尽管最大菌体浓度较低,但产物比产率及产物浓度都最高。启动子只有在低磷酸盐的情况下才被启动。
温度的影响:温度对基因表达调控作用可发生在复制,转录,翻译或小分子调节分子合成水平上。
大肠杆菌合成青霉素酰化酶不仅受苯乙酸诱导和葡萄糖调控,而且受温度调控。是由于影响了细胞内青霉素酰化酶mRNA的浓度。
十五、如何建立基因工程菌分离工艺
一、建立分离纯化工艺需了解的各种因素:
1,含目的产物的起始物料的特点。1)菌种类型及其代谢特性。2)原材料和培养基的来源及其质量。3)生产工艺和条件。4)初始物料的物理化学和生物学特性。
2,物料中杂质的种类和性质。
3,目的产物特性
4,产品质量的要求。
二、分离纯化的基本过程:细胞破碎,固液分离,浓缩与初步纯化,高度纯化直至得到成品,成品加工。
细胞破碎的方法:机械法-非机械法;物理法(匀浆法、珠磨法、超声法),化学法(渗透冲击、增容法),生物法(酶溶法)。
固液分离常用方法:离心沉淀,膜过滤,双水相萃取。
三、选择分离纯化方法的依据:
1根据产物表达形式来选择。
2根据分离单元之间的衔接选择。应尽早采用高效分离手段,将含量最多的杂质先分离去除,将最昂贵最费时的分离单元放在最后阶段。色谱分离次序的选择同样重要,经盐析后的液体不适宜于离子交换层析,但对疏水层析则可直接应用。离子交换、疏水及亲和色谱通常可以起到蛋白质的浓缩的效应。亲和层析选择性最强,多放在第二步以后。
3根据分离纯化工艺的要求来选择
1)应具有良好的稳定性和重复性。2)尽可能减少组成工艺的步骤。3)组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调,工艺和设备相适应。4)在工艺过程中尽可能少用试剂,尤其是对稳定性差的产物。5)分离纯化工艺所用的时间尽可能短,尤其是对稳定性差的产物。6)工艺和技术必须是高效,收率高,易操作,对设备条件要求低,能耗低。7)具有较高的安全性。
四、分离纯化的技术要求:1技术条件要温和,能保持目的产物的生物活性。2选择性要好,能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离出来,达到较高的纯化倍数。3收率要高。4两个技术之间要能直接衔接,不需要对物料加以处理或调整。5整个分离纯化过程要快,能够满足高生产率的要求。
十七、包含体的分离、溶解和复性:
细胞破碎→固液相分离→去污剂或低浓度尿素或盐酸胍去除可溶性蛋白和膜蛋白→高浓度尿素或盐酸胍溶解包含体,DTT打开二硫键→逐步透析或稀释去除变性剂。
第三章 动物细胞工程制药
一、 如何选择培养基(简答题):培养基的基本要求:营养成分,促生长因子,激素,渗透压,PH,无毒无污染。 1建立某种细胞株所用的培养基应该是这种细胞首选的培养基,查阅参考文献,根据细胞株建议的培养基。 2根据细胞株的特点和实验要求选择培养基。
3用多种培养基培养目的细胞,观察生长状态,可以用生长曲线、集落形成率等指标判断,根据实验结果选择效果好的。
二、 天然培养基:血清:
成分:由血浆去除纤维蛋白而形成的,血清中含有各种多肽,脂肪,碳水化合物,生长因子,激素,无机物等。 作用:1提供基本营养物质。2提供激素和各种生长因子。3提供结合蛋白。4对培养基中的细胞起到某些保护作用。 质量标准:取材对象。取材过程。促生长效果。克隆形成率。贴瓶率测定。续传代培养。
外观:透明清亮,土黄或棕黄色。无沉淀或极少。浑浊沉淀多→蛋白质变性。棕红色→取材时有溶血现象。液体稀薄→掺入生理盐水过多。
三、 合成培养基:人工设计,配制的培养基
基本培养基:优点是成分明确,组分稳定,可大量生产。氨基酸、维生素、糖类、无机盐、其他成分(酚红指示剂)。 无血清培养基:即不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间繁殖的合成培养基。HamF12与DMEM1:1混合。优点是1提高了细胞培养的可重复性,避免了血清批次之间差异的影响。2减少了有血清带来的病毒真菌支原体等微生物污染的危险。3供应充足,稳定。4细胞产品易于纯化。5避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性。6减少了血清中蛋白对某些微生物测定的干扰,便于对实验结果的分析。
无蛋白培养基:不含有动物蛋白的培养基
限定化学成分培养基:指培养基中所有成分都是明确的
平衡盐溶液:由无机盐,葡萄糖组成。维持细胞渗透压平衡,保持pH稳定及提供简单的营养。用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其它试剂。
消化液:用于取材进行原代培养时需要将组织块消化解离形成细胞悬液。传代培养时也需要将贴壁细胞从瓶壁上消化下来。EDTA溶液(破坏细胞间的连接),胶原酶溶液(上皮类细胞原代培养时使用),胰酶溶液(消化酪蛋白) 添加的抗生素:青霉素(革兰阳性菌),链霉素(革兰阴性菌)
细胞营养污染的原因途径:空气,器材,操作,血清,组织样本。
污染补救措施:抗生素排除法(有价值的细胞),加温除菌(支原体污染),动物体内接种(肿瘤细胞),与巨噬细胞共培养
第四章 抗体制药
一.单克隆抗体:将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合,通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞体系,此细胞系能产生结构和特异性完全相同的高纯度抗体。是针对一个抗原决定簇的抗体,又是单一的B淋巴细胞产生的,故称单克隆抗体。(高度特异性,均一性,有稳定来源可大量生产)
二. B淋巴细胞及特点:
三. 骨髓瘤细胞及特点:
四. 利用HAT筛选机理:1体内合成DNA两途径(主要 旁路)2HAT中有氨基蝶呤,抑制主要途径,可以利用
另两个成分旁路合成DNA,正常的B细胞有旁路途径,而肿瘤细胞没有旁路途径,B细胞与肿瘤细胞融合后有B细胞的旁路途径,比B细胞长命,所以可以存活。
五. 人-鼠嵌合抗体:在基因水平上把鼠源性单克隆抗体的重链H和轻链L可变区分离出来,分别与人Ig的重链和
轻链的稳定区C基因连接成人-鼠嵌合体的H和L链基因,再共转染骨髓瘤细胞,就能表达出完整的人-鼠嵌合抗体。
六. 改形抗体:用鼠源性单克隆抗体的CDR序列替换人Ig分子中的CDR序列,则可使人的Ig分子具有鼠源性单
克隆抗体的抗原结合的特异性,抗体分子中鼠源部分只占很小比例,可基本消除免疫原性。这种改形抗体又称CDR移植体。
七. Fab与Fv抗体:用胃蛋白酶可将IgG的重链在铰链区的C端处裂解,获得两个完全相同的抗原结合片段,由
于仍保持抗体分子的立体构型,因此在人体仍然很稳定,成为小分子抗体的雏形,称Fab抗体。具有与完整抗体相似的结合能力的抗体可变区片段称为Fv抗体
八. 单链抗体:是由一段弹性连接肽把抗体可变区重链与轻链相连而成,是具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最
小功能结构单位。优:分子小,易于分子改造,半衰期短,免疫原性低。缺:稳定性低。功能单一。亲和力低。
九. 细胞内抗体:
十. 噬菌体抗体库技术 特点:1模拟天然全套抗体库。2避开了人工免疫和杂交瘤技术。3可获得高亲和力的人源
化抗体。
十一. 噬菌体表面转释技术
十二. 获取目的基因的方法
十三. 淘筛:基本过程:抗原固化,对噬菌粒群的吸附、洗涤、洗脱和感染扩增,与辅助噬菌体超感染获得大容量
次级文库,再反复与抗原吸附,淘汰了非目的克隆,使目的克隆大量地扩增。
十四. 诊断血清的制备:1制备细菌抗原。2免疫动物和制备抗体血清。
十五. 抗体治疗药物有哪些:放射性同位素标记的抗体治疗药物,抗癌药物偶联的抗体药物,毒素偶联的抗体药物。
第六章 酶工程制药
一、酶和细胞的固定方法:
载体结合法:物理吸附法。离子结合法。共价结合法。优缺点
交联法:交联酶法。酶-辅助蛋白交联法。吸附交联法。载体交联法。
包埋法:网格型,微囊型。
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