WB-protocol

配液：

1mol/L Tris-HCl：12.114g Tris-base，加水至100ml，PH6.8

1.5mol/L Tris-HCl：18.7g Tris-base，加水至100ml，PH8.8

10％SDS： 5g电泳级SDS加水定容至50ml，可加热至68℃助溶

                 Acrylamide<!> 29g

30%丙烯酰胺     methylene diacrylamide<!> 1 g

    加水至100ml溶解，避光4℃保存

{ 将29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用Pall滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温。}

10% AP：Ammonium persulfate10%(w/v)-20℃保存一个星期，一般一次配1ml。

                         Glycine 144g

10×running buffer （1L）   Tris-base 30g

                         SDS 10g

                         加水至1L

1×running buffer （1L）: 直接从10×running buffer加水稀释

                         Glycine  145g

10× transfer buffer （1L）   Tris-base  29g

                         加水至 1L

                        10×transfer buffer 100ml

1×transfer buffer （1L）    methanol 200ml

                         加水至1L

                 Tris-base 24.2g

10×TBS （1L）   Nacl 80g

                 36%Hcl 约14ml

                 pH调至7.6，加水至1L

                 10×TBS 100ml

1×TBST （1L）  Tween-20 0.5ml（即0.05%，临用时加入）

加水至1L

封闭液(5%)：也为抗体稀释液，5g脱脂奶粉溶于100ml 1×TBST配制

                          Glycerine 2ml（20%）

20×loading buffer(变性剂)    bromophenol blue 0.03%（适量）

                          DTT 0.3ml（3%）<!>

                          4×upper tris 7.7ml

4×upper tris：Tris-base 12.12g（0.5M）、10%SDS 8ml，PH6.8，总计200ml

1×sample buffer：50mmol/L Tris-HCl(PH6.8),20g/L SDS(电泳级)，10%Glycerol

Ponceau S 丽春红: 0.1%, 0.1g溶于5ml冰醋酸;H₂O 至100ml，4℃保存。（可重复使用）

DTT

组份浓度： 1 M DTT
配制量：10mL
配制方法：
1. 称取1.545g DTT，加入到15mL塑料离心管内。
2. 加10mL的0.01 M 的NaOAc（醋酸钠）（pH5.2），溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌。
3. 适量分成小份后，-20℃保存。

    3 M 醋酸钠（NaOAc）（100 ml）
            1．称取40.8 g NaOAc&#8226;3H2O置于100～200ml烧杯中，加入约40ml的去离子水后搅拌溶解。
            2．加冰醋酸调节pH值至5.2。
            3．定容至100 ml，高压灭菌后室温保存。
            （参照《分子克隆》二版P884）
            0.01 M NaOAc (pH5.2) 参照此配方配制。

实验步骤

一、蛋白样品制备

1、 培养细胞的蛋白质样品的制备（还没做过组织的，以后补充）

a、收集：细胞培养至皿（100cm）上长满时，经PBS漂洗3次，加入1ml的1×sample buffer,细胞刮收集，冰上操作，转移至离心管中，置-20℃保存。

b、裂解：超声（超声5s间歇10s，功率100至120w）或注射器反复抽吸破碎，至细胞裂解液澄清不粘稠为止。置于冷冻离心机4℃25000g离心15min取上清；

2、 BCA（标准曲线）蛋白定量：

a. 准备蛋白标准品

 

b. 准备工作液 Working Reagent(A:B=50:1 )

所需体积=(# standards + # unknowns) × (# replicates) × (volume of WR per sample)

        c．操作步骤：

         1.吸取25ul标准品及待测样品到96孔板（复孔1个），sample/WR=1:8（如果样品量太少多，改为上10ul sample/WR=1:20，检测范围125-2,000 µg/ml）

2.加200ul的WR，摇床混匀1min；

         3．合上盖子在37℃孵育30min；

         4．冷却至室温，约20-30min

         5.在紫外分光光度计562nm下读数

         6.画标准曲线，算出待测样品浓度

3、 蛋白变性：在提取的蛋白中按每100ul加5ul 20×loading buffer混匀后，置98℃水浴锅中煮沸10min使蛋白变性。若离心5min可以避免拖尾现象。

二、制胶

1、 分离胶：一般来说，蛋白分子量越小 需要胶的浓度越大，SDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围（6%胶 50-150Kd；8%胶 30-90kD；10%胶 20-80kD；12%胶 12-60kD；15%胶 10-40kD）

按比例配制分离胶，轻缓摇动溶液8~9次，使激活剂混合均匀，配好后灌胶，然后用超纯水封胶。当水和胶之间有一条折射线时（约30min），就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

2、    浓缩胶：沿玻璃板平缓注入凝胶溶液，然后保持水平插梳（上样孔不得留有气泡），静置30min后保证完全聚合。

3、    上样，依次加入蛋白marker和待分析样品，加样时间尽量短，避免样品扩散和边缘效应，可在未加样的孔中加入等量样品缓冲液。

三、  电泳

加样完毕，盖好电泳槽盖子并选择适当恒压，一般浓缩胶80V，20min，分离胶120V，90min，电泳至溴酚蓝跑出凝胶末端处即可停止。（通电时，检查有否气泡产生）

四、电转

电泳结束后，取出凝胶，在预冷电转甘氨酸缓冲液中漂洗数秒；

1、膜的预处理： 

按胶的大小剪下相应大小的PVDF膜（在右上角剪一个缺角，作为转膜时正面的标记，下方标注蛋白名称、日期）；将PVDF膜于甲醇中浸泡3-5min，放置于转膜液中；

2、按胶的大小剪切转膜用滤纸，共6张，置于转膜液中浸湿5min；

3、将浸透转移液的海绵、滤纸、PVDF膜和胶按下列顺序从下至上放置于湿转膜器中。从下至上为：夹子透明边-海绵－三层滤纸－PVDF膜－胶－三层滤纸－海绵-夹子黑色边。用玻璃棒轻轻碾压，挤出可能存在的气泡；放入转膜器（注意方向，PVDF膜对正极，胶对负极）；

4、加入4℃预冷 Transfer buffer，80mA恒流转膜（低温），分子量50KDa左右的蛋白用120min，20KDa左右的用90min。一般转膜电流200mA之间，时间30~60min或15~20mA过夜。大片段（>50KD）可选350mA，小片段可选250mA。滤纸最好不要比膜大，防止短路，各层之间无气泡。槽内夹子两旁放入冰袋。

五、膜的封闭

进行抗体杂交前需对转印膜进行封闭，防止免疫试剂的非特异性吸附，取1×TBS漂洗3次×5min的转印膜，放入5%脱脂奶粉的封闭液内，摇床震动，室温封闭1h。

六、抗体杂交

封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体稀释液稀释的一抗，去除袋内所有气泡，封口，4℃孵育过夜或室温（22~25℃）摇动孵育1h，1×TBST洗膜3次×5min，加入5％脱脂奶稀释的HRP标记二抗（不能加叠氮钠，因为对过氧化酶有抑制作用）室温1h，1×TBST洗膜3次×5min。

七、检测辣根过氧化物酶-ECL法

增强化学发光（ECL）检测是利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质，生成不稳定的中间代谢物，其衰变时是在暗室里形成明显的肉眼可见的化学发光带，并可利用X光感光胶片记录发光结果，这里使用SuperSignal West Pico（Thermo）增强ECL发光剂，在暗室将杂交后印记膜放入显色盒中，加上混合好的显色液，用纸巾吸去多余的显色液，加盖一透明玻璃纸并抚平，将印记膜在暗室中使胶片曝光不同时间，其间冲洗胶片以确定所测抗原的最佳曝光时间。

化学显色，显影，定影

（1）将显色发光剂A、B各取1滴（1:1混匀约共1.5ml）滴于PVDF膜上，反应2-3min后，用滤纸将PVDF膜边缘或者边角多余液体吸干，加盖一层透明玻璃纸并抚平，保证干的表面与胶片接触，在暗室中放置胶片，一旦放上，便不能移动，关上暗盒。

（2） 将显影液、自来水和定影液分别到入搪瓷盘中；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min；曝光完成后，打开曝光盒，取出X光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，自来水冲洗终止显影。显影时间一般为1～3min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，自来水中漂洗数秒，把X光片浸入定影液中，定影时间一般为1min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。

 

第二篇：免疫印迹(WB法)检测技术

免疫印迹（WB法）检测技术.doc