一、名词解释

1、发酵

工业上的发酵：泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程；发酵是用生物催化剂使培养物质转变为产品的生物化学反应。

2、自然选育

利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离、筛选排除衰退型菌株，从中选出维持或高于原有生产水平菌株的过程，称为自然选育。

3、定向培育

定向培育（directive breeding）是指为了获得具有某些需要性状的品系，在一定的环境条件下长期处理某一微生物群体，同时不断移种，以达到累积并选择合适的自发突变体的育种方法。

4、诱变育种

利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促使其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究用。

5、营养缺陷型菌株

营养缺陷型：在一些营养物质（如氨基酸、维生素和碱基）的合成能力上出现缺陷，因此必须在基本培养基中加入相应的有机营养成分才能正常生长的变异菌株。

6、野生型菌株：自然界分离的任何原始菌株。

7、杂交育种

利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核微生物的接合、转化和转导等过程，促使两个具不同遗传性状的菌株进行遗传物质交换和基因重组，以获得优良性能或新的品种的生产菌株。

8、培养基

人工配制的适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。

9、前体

在发酵液中加入某种物质，它们没有改变就成为产物分子组成的一个部分，而显著增加产量或改良产物的组分，这些物质称为前体

10、分解代谢物阻遏。

被菌体快速利用的碳源如葡萄糖、枸橼酸等会产生大量的分解产物，这些分解产物阻遏次级代谢产物合成酶系，只有这类碳源被消耗完后，阻遏作用消除，菌体才由生长阶段转入次级代谢产物的合成阶段。

11、突变生物合成

在发酵培养阻断突变株时添加某种天然或化学合成的化合物作为中间体，利用这些中间体合成一些新结构化合物的过程称为突变生物合成。

12、菌体浓度

菌体浓度是指单位体积培养液中菌体的含量。

13、阻断突变株

采用一些诱变剂对药物的产生菌进行诱变，使它们丧失合成某种中间体的能力，因而不能合成原来结构的化合物，成为阻断突变株。

14、独需型突变株

这种突变株菌体能正常生长，但由于编码抗生素的某一基因发生突变而丧失抗生素的合成能力。

15、接种量

移种的种子液体积和接种后发酵罐培养液体积之比称为接种量。

16、种龄

种子罐中培养的菌丝转入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间称为种龄。

17、双水相萃取法

不同的高分子溶液相互混合，可产生两相或多相系统，利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异进行萃取。

二、填空题

1、生物技术包括的内容主要是（基因工程）、（细胞工程）、（发酵工程）、（酶工程）。

2、发酵工程制药中常用的微生物主要是（细菌）、（放线菌）、（真菌）。

3、我国CCCCM采用（斜面低温保藏法）、（冷冻干燥保藏法）、（液氮保藏法）进行菌种保藏。

4、典型的发酵设备包括种子制备设备、主发酵设备、辅助设备（无菌空气和培养基的制备）、发酵液预处理设备、粗产品提取设备、产品精制与干燥设备、副产物回收、废物处理设备等。

5、目前发酵罐主要包括（搅拌釜反应器）、（鼓泡式反应器）、（气升式反应器）。

6、发酵辅助设备主要包括：（无菌空气系统），（灭菌系统），（发酵车间的管道和阀门）等。

7、培养基主要由（碳源），（氮源），（无机盐及微量元素），（前体、促进剂与抑制剂）、（生长因子）组成。

8、培养基灭菌方法（空罐灭菌）、（实罐灭菌）、（培养基的连续灭菌）。

9、微生物发酵方式中液体发酵方式分为（分批发酵）、（补料分批发酵）、（半连续培养）、（连续培养）。

10、分批发酵中典型的四个生长周期（迟滞期）、（对数生长期）、（稳定期）、（死亡期）。

11、发酵过程中的的中间分析项目（产物产量）（pH值）（糖）（氨基氮）（菌丝形态）。

12、青霉素G的生产中，苯乙酰-CoA是限速性因子，补加（苯乙酸或其衍生物）都能增加青霉素G的产量。

13、杂合新抗生素研究中最常用的酶抑制剂是（浅蓝菌素）。

14、阻断突变株的类型是（营养缺陷型突变株）（独需型突变株）（既是营养缺陷型又是独需型突变株）。

15、一般工艺流程和单元操作分离纯化可分为4个阶段：发酵液的预处理和固液分离、初步分离（提取）、高度纯化（精制）、成品加工。

16、膜分离方法：微滤（MF）、超滤（UF）和反渗透（RO）。

17、超临界流体的萃取能力（密度与液体相近）和萃取速度（黏度与气体相近）优于一般溶剂。

18、细胞破碎方法：机械法、化学法、酶解法、物理法、干燥法。

19、发酵类型：微生物菌体本身；微生物产生的酶；微生物的代谢产物；微生物转化反应的产物；生物工程菌发酵。

20、在青霉素的发酵中，孢子瓶中的孢子接入体积较小一级的种子罐中，生长好的一级种子移种至二级种子罐，繁殖成大量菌丝后接入发酵罐，进行（三级发酵）。有的菌种生长极快，如生产四环素的金色链霉菌，只要通过一级种子罐生长，即可接入发酵罐中，称为（二级发酵）。将孢子直接接入发酵罐进行发酵称为（一级发酵）。

21、 发酵工程由三部分组成上游工程，发酵工程，下游工程。

22、菌种选育包括：自然选育、诱变育种、杂交育种等经验育种方法。

23、接种的方法：双种和倒种。

24、（突变菌株的多样性）和（生物合成酶的底物专一性）是突变生物合成中决定新抗生素产生的两个关键因素。

三、简答题

1、生物技术药物理化性质特性

（1）相对分子质量大：人胰岛素的Mr为5.734kD。

（2）结构复杂：糖蛋白类药物

（3）稳定性差：易变性失活，酶促降解

2、 药理学作用特性

（1）活性与作用机制明确（2）作用针对性强（3）毒性低（4）体内半衰期短（5）有种属特异性（6）可产生免疫原性

3、 生产制备特性

（1）药物分子在原料中的含量低（2）原料液中常存在降解目标产物的杂质（3）制备工艺条件温和（4）分离纯化困难（5）产品易受有害物质污染

4、菌种保藏措施：

（1） 挑选典型菌种的优良纯种进行保藏，最好保藏休眠体，如分生孢子、芽胞等；

（2）人为创造环境条件（如低温、干燥、缺氧、营养缺乏），使微生物生长处于代谢不活泼，生长繁殖受抑制的休眠状态；（3）尽可能用多种手段保藏同一菌株。

5、一个优良的生物反应器的要求

要求：

（1）严密的结构（密闭；杜绝杂菌和噬菌体的污染；无死角；外压>内压时，防止外部液体及空气流入反应器）（2）良好的液体混合性能（3）高的传质和传热速率（4）可靠的检测及控制仪表（精密控制系统）

6、发酵过程的影响因素及控制

（一）菌体浓度的影响及控制：菌体浓度大小的决定因素：①与菌体的生长速率密切相关

②菌体的增长与营养物质和环境条件相关

（二）营养物质对发酵的影响及控制

1、碳源的影响及控制：速效碳源；迟效碳源2、氮源的影响及控制3、磷酸盐的影响及控制4、补料控制

（三）温度的影响及控制

① 温度影响各种酶的反应速率② 温度改变菌体代谢产物的合成反向③ 温度影响微生物的代谢调控机制

（四）pH的影响和控制（五）溶氧的影响及控制（六）二氧化碳的影响及控制（七）泡沫的影响及控制（八）染菌对发酵的影响

7、基因工程菌发酵罐要求

（1）密闭性好，防止染菌及泄露（2）自动化程度高，减少基因工程菌与人的接触

（3）发酵过程中排气要经过特殊处理，以保证基因工程菌不泄露

8、生产常用的两种代谢调控方法：一是通过诱变育种的手段筛选各种突变体；二是控制微生物的培养和生长环境，影响其代谢过程

9、产生即解除分解代谢物阻遏

被菌体快速利用的碳源如葡萄糖、枸橼酸等会产生大量的分解产物，这些分解产物阻遏次级代谢产物合成酶系，只有这类碳源被消耗完后，阻遏作用消除，菌体才由生长阶段转入次级代谢产物的合成阶段。

解除分解代谢物阻遏的两种方式：① 变更碳源或氮源的配比② 采用流加方式加入葡萄糖10、生物技术下游加工过程的特点

发酵液（或培养液）是复杂的多相系统，含有细胞、代谢产物、未消耗的培养基等；分散在其中的固体和胶状物质具有可压缩性，而且，其密度和液体相近；黏度很大；属于非牛顿性液体。

四、论述题

1、发酵过程泡沫产生的原因？泡沫的危害？消除泡沫的方法？

发酵过程泡沫产生的原因

（1）通气搅拌的强烈程度（2）培养基配比与原料组成（3）菌种、种子质量和接种量（4）灭菌质量

泡沫的危害

（1）降低生产能力：在发酵罐中，为了容纳泡沫，防止溢出而降低装量

（2）引起原料浪费：如果设备容积不能留有容纳泡沫的余地，气泡会引起原料流失，造成浪费。 （3）影响菌的呼吸：如果气泡稳定，不破碎，那么随着微生物的呼吸，气泡中充满二氧化碳，而且又不能与空气中氧进行交换，这样就影响了菌的呼吸。 （4）菌体量减少：部分菌体黏附在罐顶或罐壁上，发酵液中菌体量减少。（5）引起染菌：由于泡沫增多而引起逃液，于是排气管中粘上培养基，就会长菌。随着时间延长，杂菌会长入发酵罐而造成染菌。

（6）消泡剂的加入会给提取工艺带来困难

消除泡沫的方法

（1）机械消沫：罐内消沫；罐外消沫。（2）消沫剂消沫

2、代谢产物合成的调控

（一）发酵条件的控制1、使用诱导物2、改变细胞通透性3、添加生物合成前体4、解除末端产物反馈调节5、解除分解代谢物阻遏

（二）各种突变株的应用

1、营养缺陷型突变株的应用2、抗代谢类似物突变株的应用3、抗生素抗性突变株的应用

3、青霉素的发酵工艺

（一）青霉素生产菌种（二）青霉素发酵工艺（三）发酵控制（四）提取和精制

4、优良菌种的选育

理想的工业发酵菌种的要求：

（1）遗传性状稳定（2） 生长速度快，不易污染（3）目标产物产量尽可能接近理论转化率（4）目标产物最好分泌到胞外（5） 尽可能减少类似物的产量（6） 其所利用生长的培养基成分简单、价格低廉

 

第二篇：生物制药总结

1、生物药物biological medicinal product生物制药biopharmaceuticals细胞融合cellfusion细胞杂交cellhybrization SWZY产业特点：高技术、高投入、高风险、长周期、高收益、低污染，必需氨基酸essential amino非必须氨基酸nonessential amino精AA：高血氨症，肝机能障碍；天冬aa：钾镁盐可用于恢复疲劳，低钾症心脏病；半胱aa：促进毛发生长，降低血压，心绞痛

2、L-ASP：有助于鸟aa循环，促进氨和co2生产尿素，增强肝功能

赖脯胰岛素Lispro，B29与B29对换，门冬胰岛素Novolog，天冬暗算取代b28位脯aa；赖谷胰岛素，赖aa和谷aa分别取代b3位天冬aa和b29位的赖aa甘精胰岛素glargine，甘aa取代a21位门冬aa，b链末端增加两个精aa，地特胰岛素Insulin Detemir，b29位赖aa酰基化N-16烷基酸的14碳游离脂肪酸

3、pro变性denaturation，通过胎盘through placenta

4、抗体依赖性细胞街道的细胞毒效应ADCC不提依赖性细胞溶解作用CDC

5、多克隆抗体polyclonal antibody

6、人源化抗体humanized antibody 互补决定区移植抗体，指抗体的可变区部分VhVi区或抗体所有全部由人类抗体基因所编码，嵌合、改型、表面、重塑、全人源化抗体

7、嵌合抗体利用DNA技术将异源单抗的轻重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出嵌合抗体。

8、噬菌体表面展示技术phage display technology：使用PCR技术从生物体内扩增出整套编码人抗体的基因序列，克隆到噬菌体载体上，并以融合蛋白的形式表达到噬菌体表面，从而可以方便的利用抗原-抗体特异性结合进行筛选扩增。原理：PCR技术扩增人体抗体轻重链可变区VHVL，克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式在外壳表达，用抗原抗体反应筛选出所需要抗体的克隆并扩增，抗体基因分泌表达，获得可溶性的抗体片。

抗体库：组合抗体文库：建库过程中将vh和vl随机组合，人天然抗体库：抗体RNA来源于未经免疫的正常人

9、酶类药物的选择：乙酰化酶鸽肝，凝血酶牛血，透明质酸酶羊睾丸，溶菌酶鸡蛋清，SOD血肝

10、

 

第三篇：生物技术制药重点总结+个人总结

第一章                    绪论

1.      生物技术的概念，基因工程、细胞工程、发酵与酶工程、蛋白质及抗体工程及生物转化的概念。P1

生物技术biotechnology又称生物工程bioengineering，指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术。

基因工程genetic engineering也称遗传工程，是现在生物技术的核心和主导。主要原理是应用人工方法将生物的遗传物质，通常是DNA分离出来，在体外进行切割、拼接和重组，然后将重组了的DNA导入某种宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传品性；有时还使新的遗传信息在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物（多肽或蛋白质）。（DNA重组技术，分子杂交技术，基因操作）

细胞工程cell engineering 指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动植物个体，或获得某种有用的物质的过程。

发酵工程fermentation engineering 是通过现代技术手段，利用微生物的特殊功能生产有用的物质，或直接将微生物应用于工业生产的一种技术体系。

酶工程enzyme engineering 是利用酶或细胞所具有的特异催化功能，或对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术。

抗体工程antibody engineering是利用细胞生物学或分子生物学手段在体外进行遗传学操作，改变抗体的遗传特性和生物学特性，以获得具有适合人们需要的、有特定生物学特性和功能的新抗体，或建立能稳定获得高质量和产量抗体的技术。

生物转化biotransformation也称生物催化biocatalysis是利用酶或有机体（细胞、细胞器）作为催化剂实现化学转化的过程，是生物体系的酶制剂对外源性底物进行结构性修饰所发生的化学反应。

2.      生物技术药物biotechnological drug 是指采用DNA重组技术或其他生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白或核酸类药物。  

生物技术药物的特性：

（1）理化性质特性：相对分子质量大，结构复杂，稳定性差。

（2）药理学作用特性：活性与作用机制明确，作用针对性强，毒性低，体内半衰期短，有种属特异性，可产生免疫原性。

（3）生产制备特性：药物分子在原料中含量低，原料液中常存在降解目标产物的杂质，制备工艺条件温和，分离纯化困难，产品易受有害物质污染。

（4）质量控制特性：a质量控制内容的特殊性（质量标准：基本要求、制造、检定等；化学药物的质量标准：性状、鉴别、检查、含量测定等），b制造项下的特殊规定，c检定项下的特殊规定。

3.      生物技术制药biotechnological pharmaceutics是指利用基因工程、酶工程、发酵工程、细胞工程、蛋白质工程等生物技术，来研究、开发和生产用于预防、治疗和诊断疾病的药物。

第二章   基因工程制药

4.      外源基因在原核生物中表达的重要调控元件        P17

A启动子promotor是DNA链上能与RNA聚合酶结合并起始mRNA合成的一段序列，其功能是起始目标基因mRNA的合成，是决定外源基因在原核生物中表达效率的关键因素。

B核糖体结合位点：SD序列。C终止子：终止子序列terminator sequence是基因3’-末端能被RNA聚合酶识别并停止转录功能的特定DNA序列。

5.      外源基因在大肠杆菌中的表达方式：P18  a胞内表达：非融合蛋白的胞内表达和融合蛋白的胞内表达，b分泌表达：分泌至周质和分泌至胞外。

6.      大肠杆菌中外源基因表达效率的影响因素   P18-P19

A外源基因密码子，B、mRNA结构，C表达载体，D、外源蛋白稳定性

7.      酵母表达系统的优点：高表达量，高稳定性，翻译后修饰功能，分泌表达。

8.      外源蛋白在酵母表达系统中的影响因素        P20

a外源基因结构，b表达形式及信号肽的选择，c启动子，d转化子的拷贝数，

e甲醇诱导浓度、时间、温度，f外源蛋白的降解。

9.      基因工程药物的质量控制与小分子药物质量控制相比，不同的方面 P30

A鉴别方法不同：基因工程药物的Mr远大于小分子化学药物。

B鉴定方法不同：基因工程药物结构复杂（空间结构），需要多种检测方法。

C杂质来源不同：基因工程药物杂质来源于宿主蛋白残留和宿主基因残留。小分子药物杂志来源于合成过程中原料残留、合成副产物和纯化中溶剂残留。

D药物定量方面，基因工程药物定量方法一般采用生化反应的方式。

10.  基因工程药物质量控制的项目：a蛋白含量测定、b蛋白纯度分析、c蛋白性质测定、d生物学效价测定、e杂质分析等。

(1)蛋白质含量测定方法：

a.紫外吸收法：280nm处吸收峰，优点：快速、对蛋白质无破坏性。缺点：不是严格定量，核酸可引起强干扰。

b .BCA法：二辛可宁酸bicinchoninic acid,在562nm处有最大吸收。

c .Lowry法：福林-酚试剂，灵敏，准确度高，操作步骤多，影响因素多。

d.考马斯亮兰法：595nm处有最大吸收。灵敏，操作简单，抗干扰能力弱。

e. SDS-PAGE扫描分析法。

(2)蛋白质纯度检测的方法：a电泳法，b质谱法，c层析法，d末端氨基酸残基分析法。SDS-聚丙烯酰胺凝胶法（电泳法）是目前最常用的鉴定蛋白质纯度的方法。

                             第三章 动物细胞工程制药

动物细胞工程animal cell engineering 是指根据细胞生物学及工程学原理，定向改变动物细胞内的遗传物质从而获得新型生物或特种细胞产品的一门学科。

11．体外培养动物细胞的类型P47：贴壁依赖性细胞、非贴壁依赖性细胞、兼性贴壁细胞。

12．动物细胞培养的条件P48：培养温度25-28度。PH值7.2-7.4，低于6.8或高于7.6对细胞生长不利。通氧量：CO2培养箱。防止污染：显著污染的标志PH值迅速改变、细胞外形模糊、出现漂浮的细胞集落，加入抗生素。基本营养物质。渗透压。

动物细胞培养特性：（1）细胞比微生物细胞和植物细胞大，抗机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差，（2）倍增时间长，生长缓慢，（3）对培养基要求高，易受污染，加入抗生素。（4）贴壁生长，有接触抑制现象。（5）产物分泌于细胞外。

13．培养方式：细胞的原代培养、传代培养、细胞克隆培养P50

原代培养：组织块培养法和单层细胞培养法

组织块培养法tissue culture 是将动物组织切成直径1~2mm3小块进行培养的方法。

单层细胞培养法monolayer cell culture是将动物组织块中粘连在一起的细胞用酶法或物理分散法分散成单个细胞，制成细胞悬液，经计数、稀释后，接种于无菌培养液中，37C、5%CO2空气下进行原代培养，细胞即开始生长并逐渐形成单层。

细胞克隆培养法clonal culture即单细胞分离培养，是将动物组织分散后，将一个细胞从群体细胞中分离出来，由单个细胞培养成纯系细胞集群。饲养细胞：小鼠胸腺细胞、腹腔细胞。

14．动物细胞培养常用的其他溶液P55：平衡盐溶液、培养基PH调整液、细胞消化液（胰蛋白酶溶液、EDTA液）、抗生素溶液（青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素）。

15．动物细胞的大规模培养方法P59：A悬浮培养法Maitland’s culture，B微载体培养法，C多孔载体培养法，D微囊化培养法，E中空纤维培养法hollow filer cell culture是模拟细胞在体内生长的三围状态，把细胞接种在中空纤维的外腔，利用中空纤维模拟人工毛细血管供给营养可以使细胞高密度的生长。

16．动物细胞生物反应器的类型P61：a搅拌式生物反应器、b气升式生物反应器、c中控纤维式生物反应器、d透析袋式或膜式生物反应器、e固定床或流化床式生物反应器、f一次性摇袋式细胞培养生物反应器。

17．动物细胞生物反应器的主要操作模式P65：a分批式操作、b补料-分批操作、c半连续式操作、d灌流式操作、e连续式操作。

18．转基因动物制作方法P67：a基因显微注射法、b反转录病毒感染法、c胚胎干细胞法、d精子载体导入法、e基因打靶法、f酵母人工染色体法。

转基因动物transgenic animal：采用基因工程技术把外源目的基因导入动物生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体动物的染色体上稳定整合，再经过发育途径把外源目的基因稳定地传给子代，通过这项技术所获得的动物即使转基因动物。

19．细胞核移植技术nuclear transplantation 是指一个动物的细胞核移植至去核的卵细胞中，产生与供细胞核动物的遗传成分一样的动物的技术。P73

第四章    抗体工程制药

20．抗体工程制药antibody engineering pharmaceutics 是指利用基因工程、细胞工程和转基因动物及转基因植物技术生产抗体药物的过程。P78

单克隆抗体monoclonal antibody, mAb 简称单抗，是由一个B细胞和一个骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤细胞合成及分泌的抗单一抗原表位的特异性抗体。

21．单克隆抗体 及其制备原理（主要是理解） P79

22．抗体的结构P81：4条多肽链（2条相同的重链和2条相同的轻链）通过二硫键连接而成，为“Y”字形结构。

23．杂交瘤细胞的筛选P90：HAT选择性培养基。

24．噬菌体抗菌库技术的筛选方法P105：（1）固相或液相纯化抗原的筛选：a将纯化抗原包被在固相介质上（酶标板、免疫试管、亲和层析柱），然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体。b将抗原与生物素集团相连，再将其结合在包被有链亲和素的磁珠上对噬菌体进行筛选。（2）全细胞筛选，（3）用切片组织进行筛选

第五章    疫苗及其制备技术

本章内容主要以老师的课件为主

疫苗vaccine是由病原微生物本身制备而成的抗病制剂，广义的疫苗包括细菌、病毒和立克次体等病原微生物制成的疫苗，注射或黏膜途径接种后使机体产生抗体或致敏淋巴细胞，达到特异性免疫的效果，使机体获得保护或消灭该致病原。

25．毒株须具备的条件：

（1）持有特定的抗原性；

（2）有典型的形态和感染特定组织的特性，并能保持其生物学特性；

（3）易在特定组织中大量繁殖；

（4）不产生神经毒素或能引起机体损害的其它毒素；

（5）如制备活疫苗，繁殖过程中无恢复原致病性的现象；

（6）未被其它病毒污染。

强毒种的选育：

（1、强毒种来源：典型传染病分离培养;保藏中心提供。

（2、强毒种分离：A、纯粹试验（分离培养、鉴定）。

B、致病力（动物、鸡胚、细胞试验）。

C、抗原性（免疫及反应抗原试验）。

D、稳定性（传代不变异）。

达到：毒力强，纯粹，抗原好，稳定的菌种，最后冻干保藏。这就是强毒菌种的标准。

（3.复壮：弱毒菌种在敏感动物或细胞上多次传代，达到毒力增强的目的 

弱毒种的选育：（1、来源：自然界筛选和人工诱变。

（2、弱毒筛选途径：初选的依据：生物性状改变。

26．活疫苗（live vaccine）：选用无毒或弱毒但免疫原性高的菌种，经培养、繁殖后制成的。

死疫苗（killed vaccine）：包括灭活疫苗（由完整的病毒或细菌经灭活剂灭活后制成，即要使病原体充分死亡，丧失感染性或毒性和致病性，又要保留其免疫原性）和 亚单位疫苗（将病原体经物理或化学方法处理，除去无效物质，提取其有效抗原部分制备的一类疫苗）

活疫苗与死疫苗的特点

27．疫苗的质量检测：（1．外观检查：（2．pH值检测： （3．纯度：（4．宿主细胞 DNA和蛋白残留量检测：（5.无菌检查：（6．热原或细菌内毒素检查：（7．抗生素检测：（8．灭活效果的验证：（9．异常毒性检查：（10．稳定性试验：（11．效力试验（生物效价）：（12．佐剂的质量评价：（13．疫苗标准品或参考品的研究：

28．多糖的纯化方法：A乙醇沉淀法（最常用），B分级沉淀法（用不同浓度的有机溶剂分级沉淀分子大小不同的粘多糖），C季铵盐络合法，D离子交换层析法，E凝胶过滤法

29．粘多糖的生物学特性：粘多糖是指含有氨基糖和糖醛酸或它的衍生物的多糖。

                      第六章   酶工程制药

30．酶的催化的显著特点P150：A催化效率高，B具有专一性，

C催化作用在体内受到调节控制(区别于一般催化剂的重要特征)，D不稳定性。

31．酶分离纯化的一般程序  及 酶原料选择的依据  P153

一般程序：（1,、原材料的选择和预处理：选择含目的酶丰富的原料，

（2、酶的分离，（3、酶的精制，（4、酶的浓缩干燥及结晶。

32．传统的酶固定化方法P155：

（1、载体结合法：物理吸附法、离子结合法、共价结合法，

（2、交联法cross-linking method：是利用双功能或多功能交联试剂，在酶分子和交联试剂之间形成共价键的酶的固定化方法，常用交联剂戊二醛、己二胺等。（3、包埋法entrapment method :是载体与酶溶液混合后，借助引发剂进行聚合反应，通过物理作用将酶固定在载体的网格中，从而实现酶固定化的方法。有网格型和微囊型。常用载体有明胶、聚酰胺、琼脂等。

固定化酶immobilized enzyme或固定化细胞immobilized cell是将具有一定生理功能的酶或生物细胞，用物理或化学方法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用的一种技术。

33．固定化酶的性质和指标以及其优缺点P159：

（1、固定化后活力的改变（增强），

（2、固定化对酶稳定性的影响：热稳定性提高，对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高，对PH、蛋白酶、贮存和操作条件的稳定性提高，

（3、固定化酶的最适温度变化：提高，

（4、固定化酶的最适PH值变化：用带负电荷载体，最适PH向碱性偏移；用带正电荷载体最适PH向酸性偏移。

（5、固定化酶的米氏常数Km变化：中性载体，Km上升；底物与载体电荷相同，Km增加；底物与载体电荷相反，Km减小；高级结构变化及载体影响引起酶与底物亲和力变化，从而Km变化，Km还受离子强度的影响，I升高，Km变化逐渐缩小甚至消失。

（6、固定化酶的指标：A固定化酶的活力，B偶联率及相对活力的测定，

C固定化酶的半衰期，D固定化酶的热稳定性

34．酶反应器的基本类型P162：a搅拌罐式反应器，b鼓泡式反应器，

c膜反应器，d喷射式反应器，e填充床式反应器，f流化床式反应器

35．酶传感器的主要类型P162：A酶电极，B热敏电阻酶传感器，

C离子敏场效应晶体管酶传感器，D光纤酶传感器

36．酶反应器的性能评价P166：

A固定化酶的形状，B底物的物理性质，C固定化酶稳定性，D酶反应动力学特性。参数：空时、空数、转化率、生产强度。

37．酶反应器应用的注意事项P169：保持酶反应器的操作稳定性，保持酶反应器中流体的流动方式和状态，防止酶的变性，防止微生物的污染。

38．酶分子的定向进化P173：

定向进化directed evolution和杂合进化hybrid evolution是非理性化设计。

酶分子的体外定向进化directed molecular evolution in vitro of enzyme 是指不需要了解酶的空间结构和催化机制，而是人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对酶基因进行改造，并定向筛选、获得具有某些预期特征的进化酶。酶分子体外定向进化的策略：随机突变、同源改组、非同源改组、结构域改组。

39．突变酶的概念P172：

突变酶mutational enzyme 是指采用基因工程技术对天然酶基因进行剪切、修饰或突变，通过表达修改的基因获得的在酶学性质上符合需要的酶。

抗体酶abzyme又称催化抗体，是一类免疫系统产生的、具有催化活性的抗体。

40．酶的化学修饰chemical modification of enzyme 利用化学手段将某些化学物质或集团结合到酶分子上，或将酶分子的某部分删除或置换，改变酶的理化性质和生物活性，这种应用化学方法对酶分子进行改造的技术称为酶的化学修饰。

方法：a交联技术（戊二醛交联剂）、b定点突变和化学修饰结合技术、c用小分子化合物的修饰、d用单功能聚合物的修饰（PEG常用化学修饰剂，提高稳定性、降低免疫原性）、e引入辅助因子。   P177

                   第七章      发酵工程制药 

41．发酵工程的概念fermentation engineering又称微生物工程，是将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机的结合，利用微生物的特定形状，通过现代工程技术在生物反应器中生产工业原料和工业产品并提供服务的一种技术体系。生物技术的四大支柱：发酵工程、基因工程、细胞工程和酶工程。     P188

42．发酵的定义：

发酵fermentation泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程。即发酵是用生物催化剂使培养物质转化成产品的生物化学反应。生物催化剂biocatalyst是细菌、放线菌、真菌或其解体产物（如酶）和动植物细胞等。      P188

43．发酵工程制药的基本过程：上游工程、发酵生产、下游工程。P205

44．微生物发酵生产药物的分类：（1抗生素类，（2氨基酸类，（3核苷酸类，（4维生素类，（5甾体类激素，（6多糖类，（7治疗酶及酶抑制剂。   P190

45．优良菌种的选育      P195

理想的工业发酵菌种的要求：

a遗传性状稳定；b生长速度快，不易污染；c目标产物产量尽可能接近理论转化率；d目标产物最好分泌到胞外；e尽可能减少类似物的产量；f其所利用生长的培养基成分简单、价格低廉。

菌种选育：经验育种方法有自然选育、诱变育种、杂交育种等；定向育种方法有控制杂交育种、原生质体融合、基因重组等。

（1自然选育natural screening：微生物不经人工处理可以发生自发突变，利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离、筛选排除衰退型菌株，从中选出维持或高于原有生产水平菌株的过程。

（2定向培育directive breeding是指为了获得某些需要性状的品系，在一定的环境条件下长期处理某一微生物群体，同时不断移种，从而积累和选择合适的自发突变体的育种方法。

（3诱变育种mutation breeding 是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促使其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法从中挑选出少数符合育种目的的突变株。优点：方法简单、快速和收效显著，是目前主要的育种方法之一，在生产中得到广泛的应用。

（4杂交育种hybridization breeding 指利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核生物的接合、转化和转导等过程，促使两个具不同遗传性状的菌株进行遗传物质交换和基因重组，以获得优良性能或新的品种的生产菌株。是重要的微生物育种手段，具有强的方向性或目的性。

（5原生质体融合protoplast fusion又称细胞融合cell fusion，指通过人工手段，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程。是工业微生物育种的重要手段，可使一些未发现有转化、转导和接合现象的原核生物之间及微生物种、属、科间甚至更远缘的微生物细胞间进行融合，获得新物种。

菌种保藏：选典型菌种的优良纯种，最好保藏休眠体（分生孢子、芽孢）；创造条件使之成休眠状态；多种不同的手段保藏同一菌种。

保藏方法：

a.斜面低温保藏法：4度冰箱，1~6个月，适用各类菌种，简便、存活率高，保藏期短、代传次数多、易变异和污染。

b.石蜡油封存法：低温4C/室温、阻氧、灭菌，1-2年中期保藏，适用各大类菌种，不适于分解烃类菌种。

c.砂土管保藏法：4C/室温，灭菌干燥真空密封，隔氧、无营养，1~10年，常用的长期保藏法，适于产孢子的微生物及行成芽孢的细菌，不适于对干燥敏感的细菌。

d.麸皮保藏法：曲法保藏，低温干燥，1年以上，适于产孢子的霉菌及放线菌，工厂采用较多。

e.甘油悬液保藏法：-20度，0.5~1年；-70度，10年。基因工程菌常用保藏法。

f.冷冻真空干燥保藏法：冻干法，5~15年，适于各类微生物，目前被广泛采用。

g.液氮超低温保藏法：-196度，15年以上，适用于各类微生物，是目前公认的最有效的长期保藏技术之一。

h.宿主保藏法：适于专性活细胞寄生微生物（病毒、立克次体）。

46．发酵设备：

发酵罐的基本类型有搅拌釜反应器、鼓泡式反应器、气升式反应器。

发酵辅助设备：无菌空气系统、灭菌系统、发酵车间的管道及阀门等。 P200

47．发酵过程中的中间分析项目：P210

（1、产物产量：通过监测产物产量判断发酵结果，化学测定法。

（2、PH值：代谢产物影响培养液pH值，通过培养基中的组分维持合适的pH值，或通过人工方法进行调节。

（3、糖：糖的消耗反应菌体代谢活力的变化。通过糖量测定，间接推测产物生物合成效率。

（4、氨基氮：通过测定游离氨基酸的数值，侧面反应微生物含氮物质的代谢，推测发酵情况。

（5、菌丝形态：通过检测菌丝形态，监测微生物生长状态，及时调整发酵策略。   

48．发酵过程的影响因素及控制：   P211

（1、菌体浓度的影响及控制：菌体浓度是指单位体积培养液中的菌体含量。菌体浓度对发酵产物的影响：a适当生长速率下，产物的产率和菌体浓度成正比;b菌体浓度过高，使营养物质消耗过快，有毒物质积累，溶解氧减少，抑制产物生成;c菌体浓度过低，产物生成减少。

菌体浓度的控制：通过控制培养液中营养基质的浓度。基础培养基各成分要有适当配比。通过中间补料调整培养基成分，如当菌体浓度太低时，可补加一部分磷酸盐和碳源促进生长。

（2、营养物质对发酵的影响及控制：

a碳源：速效碳源：迅速被利用，有利于菌体生长，如葡萄糖、枸橼酸。迟效碳源：缓慢被利用，有利于次生代谢产物的合成，如淀粉多糖、乳糖、油脂。常用含有两种碳源的培养基进行控制。B氮源：速效氮源：迅速被利用，有利于菌体生长，如玉米浆，氨基态氮的氨基酸。迟效氮源：缓慢被利用，有利于次生代谢产物的合成，如黄豆饼粉。用含有两种氮源的培养基进行控制。C磷酸盐：对初级代谢产物，磷酸盐通过促进细菌生长对产物生成进行调节。对次级代谢产物，常采用生长亚适量的磷酸盐，提高产物生成。D补料的控制：在发酵过程中，通常补加基质和前体，促进产物合成。作用：避免菌体过度衰老，使产物合成期延长。控制pH值和代谢方向。补足发酵液体积，改善通气。

（3温度的影响及控制：发酵热=生物热+搅拌热-蒸发热-辐射热-显热

影响：a影响酶的反应速率。b影响代谢调控机制。c通过改变发酵液的物理性质影响产物合成。温度的控制：A在发酵不同阶段，采用不同温度:初期提高温度，促进菌体生长;中期降低温度，促进产物合成;后期提高温度，节省发酵时间。B针对不同条件，采用不同温度：通气差，培养基稀薄时，降低温度；通气好，培养基影响丰富时，升高温度；菌体生长快时，维持较短时间高温；菌体生长慢时，维持较长时间高温。

（4、PH值的影响及控制：对发酵的影响：影响酶的活性；影响膜通透性；影响中间成分和代谢物的解离；改变代谢途径。

碳源过多，pH↓；氮源过多，pH↑

PH的控制：a调节培养基组分，增加缓冲体系；b补料；c补加酸碱。（5、溶氧的影响及控制：需氧发酵，溶氧最易成为限制因素 。溶解氧作为发酵中氧是否足够的度量。发酵过程中，应保持在临界氧浓度以上。溶解氧的变化及原因：A异常下降的原因：a染好气性杂菌、b菌体代谢异常、c机械设备故障、d控制系统变化。B异常升高的原因：污染烈性噬菌体。溶氧的控制：a调节搅拌转速和通气率，b控制菌体浓度，使细菌比生长速率略高于临界值（菌体浓度增加，导致耗氧量增加，氧传递速率减少）。

（6、CO2的影响及控制：CO2对发酵的影响：a CO2及HCO3-影响细胞膜的结构：浓度过高将降低细胞膜的运输效率，抑制细胞生长。b降低发酵液pH值，使溶氧下降等。CO2的控制：a控制通气量、b控制搅拌速度、c控制补料工艺。

（7泡沫的影响及控制：泡沫对发酵的影响：a降低生产能力、b引起“逃液”、c影响细菌呼吸、d使发酵液菌体量减少、e增加染菌机会、f消泡剂带来提取工艺的困难。

泡沫的消除：a机械消沫；b消泡剂消沫

（8、染菌对发酵的影响：染菌的危害：a影响产量和产品质量、b倒罐、c停产。控制：a设备无渗漏、b管道系统无渗漏、c空气净化系统正常。

第八章   微生物转化

49．微生物转化的概念、反应类型及应用实例      P242-243

微生物转化microbial transformation是微生物通过酶催化将一种物质（底物）转化为另一种物质（产物）的化学反应。

类型：（1氧化反应：工业上大规模生产葡萄糖酸主要采用微生物转化。氯霉素的微生物氧化反应。（2还原反应：组氨酸的微生物还原反应。（3水解反应：酯的水解、苷的水解、硫醚开裂等。（4缩合反应：制备麻黄碱中间体1-苯基-1-羟基丙酮。（5其他反应：间型霉素B的微生物胺化反应。

这一章老师没过多的说，估计不会有问答题。

第九章            蛋白质药物的化学修饰 

50．蛋白质化学修饰的概念及内容     P279

蛋白质的化学修饰chemical modification of protein：凡是通过基团的引入或去除而使蛋白质一级结构发生改变的过程。包括侧链基团改变和主链结构改变。 

51．化学修饰剂选择的一般原则   P281

a修饰剂毒性、抗原性、稳定性

b修饰剂反应活性及对修饰位点的选择性

c修饰剂与蛋白质连接键的稳定性

d修饰剂对蛋白构象及生物活性的影响

e是否适于建立快速、方便的分析、分离纯化方法

f修饰剂是否价廉易得

52．蛋白质化学修饰的意义：（课件：重点记忆）      P280

(1循环半衰期延长

(2增大分子量，避免肾小球滤过

(3免疫原性降低或消失，毒副作用减少

(4物理、化学和生物稳定性增强

(5增加药物溶解度，延长体内水解时间

53．修饰策略        P281

?    随机修饰（random modification）：氨基（游离赖氨酸残基e-NH2）

?    定点修饰（site specific modification）:针对特定基团或专一位点进行修饰，有利于保持蛋白质药物活性，质量易控。

氨基（N-末端a-NH2）、巯基（-SH高亲和性）、羧基（-COOH）

54、聚乙二醇化修饰：

（1）PEG优势：a无毒性、两亲性、无抗原性、强生物相容性。b为避免在修饰过程中发生交联和团聚，常采用单甲氧基聚乙二醇(mPEG) 衍生物作为修饰剂。

（2）选择PEG需考虑因素：

a PEG的Mr：Mr越大，蛋白活性、免疫原性越低，稳定性越高、半衰期越长。

b选择非活性部位氨基酸残基作为修饰位点：定点修饰优于随机修饰。

c水解稳定性及反应活性：pH控制。

（3）定点修饰--氨基修饰：

A、N末端?-NH2的定点修饰（烷基化修饰）：

?  -NH2一般具有较小的pKa值，同时醛只与伯胺偶联

B定点突变去多余的氨基后修饰：去除赖氨酸?-NH2

C保护剂定点保护与脱保护修饰：9-芴甲氧羰基（FMOC）、叔丁氧羰基（BOC）

D氧化去氨基反应后修饰：磷酸吡哆醛PLP、PEG-酰肼或PEG-氧氨成腙。

（4）PEG末端-OH是其功能基团，但反应活性较差，须经活化后方可用。

活化剂：氰脲酰氯、溴化氰、N-羟基琥珀酰亚胺、羰基二咪唑、苯基氯甲酸酯等。

                     第十章     新型生物技术制药

反义核酸（antisense nucleic acid）：能够与DNA 或mRNA发生特异性结合，分别阻断核酸的转录或翻译功能，阻止与病理过程相关的核酸或蛋白质的生物合成。这种可与DNA或信使RNA结合的互补链称作反义核酸。

核酶（rybosyme）：具有生物催化功能的RNA。