精液常规分析的质量保证

《临床检验杂志》徐建平精液分析必须有质量控制

男科实验室必须为正确诊断和卫生保健决策提供可靠的

结果。由于精液分析高度复杂，操作难以标准化，因此必须进行质量控制（QC）以发现并纠正形态误差和结果的高度变异性。

比他实验室之间在纠正浓度、活力和系统性评价上的巨大差异，使强化质控和标准化的需求更加迫切。

质量控制的目的

常规精液分析中质控的目的是检测并尽可能降低随机误差和系统误差的程度。必须是这些误差最小化，从而使实验结果尽可能的接近真值，是结果可信并被临床医生和研究人员使用。

执行质量保证项目的重要性

每个实验室无论规模大小，都应该在标准化方法和操

作的基础上执行质量标准（QA）项目，一保证结果的准确性和精确性。无论如何，纠正浓度、系统性和活力等基本参数应该始终有内部质量控制的监控，可能的情况下还应该参加外部质量控制。

精液分析相关的质量保证

从男科医师写精液分析申请单起，到男科实验室发出精液检查报告止，为了控制此间可能出现的各种误差，男科实验室所采取的行政和技术上的各种有效措施，包括质量控制的措施，称作精液常规分析的质量保证，是整个男科实验室质量保证的主要部分。

质量标准计划的核心

精液常规分析欲得到可接受的结果，需要知道并实施一个

连续性的质量标准项目，对实验室提供的数据定期进行检测和评价，预防、检查、修正出现的问题。

质量标准项目必须在质量手册（QM）中描述，内容包括标

准操作程序（SOP）和一套关于实验室操作程序和方法的详细指南。指南包括一系列表格和文件。

使用CASA也要制定SOP

有关精液常规分析的SOP内容很多，涉及许多细节，每个实验室需

分别对浓度、活力、形态学制作SOP。为叙述的方便，把三者共同的部分合在一起讨论。一些操作细节WHO第5版已详细描述，这里只突出重点作为提醒。各实验室应根据自身的质量控制目标，制定相应的SOP。

由于我国多数实验室使用精子分析仪（CASA）进行精液分析，下

面所陈述的SOP主要针对仪器而言。

浓度与活力、形态学SOP：精液采集

禁欲的时间：

待做精液常规检查者的禁欲天数规定为2-7天。

实验室人员应对准备采集精液标本者细心交代相关注意事项。

采集室：

尽量靠近实验室，最好是在实验室隔壁，通过有私密性保障的传递窗传递标本。

精液的收集：

采用一次性广口容器为采精器皿，保证精液没有丢失。

采精器皿最好呈漏斗形，与带盖的离心管相连，防止污染，有利于热的传递。操作人员应对标本做好标记，核对送检者的信息。

浓度与活力、形态学SOP：精液体积的测量

准确测量精液体积是获得一次射精的精子总数准确性的关

键步骤。操作人员收到精液标本后应立即连带容器一起称重，然后将容器置于37℃恒温条件下等待精液液化。

采用WHO第5版推荐的天平称重法计算精液体积。天平应具有自动去皮功能，以减少去皮的人为误差。天平的精度要达

0.01g，保证精液体积的精确度达0.1ml的标准。天平每年必须校验一次，并做好校验记录。。

浓度与活力、形态学SOP：液化、外观、PH

1）            精液如果再39分钟内不液化，不要开始进行精液分析，而是在等30分钟。如果60分钟后仍为液化，应采用机械处理

或应用菠萝蛋白酶消化。

2）            PH值应在液化后的同一时间测量。

3）            在精液液化的同时观察其外观并做好记录。

浓度与活力SOP：显微镜

使用5版推荐的相差显微镜，相差显微镜这种能够将精液

中的大部分杂质与精子区分的高级光学系统，使精子头部发光，杂质却与普通生物显微镜一样显示为灰色，这样可以过滤掉大部分的杂质。

显微镜要每天擦拭干净，结束油镜观察后要及时清洁镜头。每年至少用对中望远镜对相位环校验一次，并做好校验记录。

浓度与活力SOP：精子计数板

必须使用生产过程有质控措施和品质管理的精子计数板 ，需要有计数池深度检测报告。

建议使用的计数板的深度应符合以下标准：

10μm±0.5μm 间隙平行度标准：

多点检测的最大值和最小值误差小于0.5μm

计数板使用前要清洗干净(可使用洗涤剂和超声波清洗机)，确保没有灰尘或水痕影响计数板的深度及背景。

计数板的深度每6-12个月必须校准一次，并做好校验记录。

浓度与活力SOP：37℃恒温条件

1）            精液采集后应迅速送抵实验室，并立即置于37℃水浴箱或金属浴多孔保温块内。

2）            精子计数板在使用前至少放在37℃恒温预热台上预热10分钟以上。

3）            最好使用专门适合相差显微镜使用的精子计数板专用恒温载

物台。

浓度与活力、形态学SOP：精液的混匀和抽样

1）      精液在取样用于检测前，应充分混匀标本。可使用二维摇动器

而不能使用漩涡震荡器。

2）      每份标本要重复抽样，在每次取样前都要再次混匀标本。

3）      只有在重复取样的结果一致时才认可此测定值。

检查足够多的精子减少抽样误差

每个实验室都要权衡专家精液分析精确度与世界花费几检测人

员疲劳导致准确性下降之间的利弊。检测精子浓度与活力，每次至少检测200条精子，抽样误差是7%，若抽样在查200条精子，则合并抽样误差小于5%，可以达到WHO第5版的要求。形态学检查比较耗时复杂，最少每次检查100条精子（误差为10%），重复检查的合并抽样误差可以更小些。

因为要减少抽样误差而增加数倍的工作量，在人员无法增加

时，唯一的出路是使用合符要求的CASA。

取样和加样时注意的SOP细节

许多操作细节必须在SOP中予以规定，如：

●稀释精液时抽取的样本量要大于0.5ml，使样本具有代表性。

●做浓度与活力检测时加样的量要严格控制在5μl，太少会产生气泡。

太多会增加精液浮力而影响计数池间隙的准确性。

●样本滴加到计数池后要将计数板继续放在预热台上静置30～60秒，减少液体流动的影响。

●精子有趋热和趋光的特性，采用发热的卤素灯做显微镜的光源时，整个检查时间最好在1～2分钟内结束，同时可避免液体蒸发对精子浓度的影响。

计数时注意的SOP细节

●若使用CASA做浓度检测，每份标本在正式检查前应该先在显微镜下使用网格计数板初略评估一下大致浓度，对于浓度超过50×10⁶/ml 的标本一定要稀释，最好用同标本的精浆稀释或用培养液稀释。

●CASA可能会把一些面积与精子头类似的杂质误判成不动精子；由于精子浓度过高且活力较强时发生的精子碰撞现象增加，被撞的不动精子易判成活动精子，而主动碰撞的精子会在碰撞前后易被判成2 条精子。

●最好利用计数板盖板上的网格预先规定检查视野，减少人为选择视野造成的随机误差。

●对于边框压线的精子数下不数上，数右不数左。

精子特别稀少甚至没有时的SOP

●当精子浓度＜5×10⁶/ml时，应检查3mm×3mm网格范围甚至整个

计数池。

●对疑似无精子的标本，应该将1ml标本离心（3000g15分钟）后

检查沉淀物，在任一重复样本中观察到精子，提示隐匿精子症；如果两个样本都未观察到精子则提示无精子症。

形态学SOP：染色剂与温度的稳定性

●每个实验室做精子形态学分析时必须固定一种染色方法，分析结果

才有可比性。

●染色液的质量有有保障，来源一定要稳定。染色剂盒应按要求妥善保管、储存和正规使用。记录每批次的批号。每次启用新的瓶装染色液时，应实验室保留的标准染色片进行比较，以期发现和分析可能存在的问题。

●染色温度对染色效果的影响很大，往往不能通过延长染色时间来弥补，所以一年中的染液温度（使用时）应该恒定，且最佳温度是

25-30℃，使用恒温染缸可以达到保温的效果，但应提前2-4小时开启电源，以保证染液温度的均衡性。

形态学SOP：染色方法和时间

●为保证染色效果的一致性，两次取样分别制作的2张涂片，要背靠背地同时染色。

●认真记录每瓶染液的染色玻片数，到规定的上限时要及时更换整瓶染液，不可新旧染液同时使用。

●要使用秒表等计时工具，不能凭经验数数。

●尽量快速沥干玻片上的残留染液，减少上一种染色剂对后道程序的影响。

●绝不能把已经染好的涂片放在水龙头下冲洗，水流过大会导致整体染色背景变浅，尤其是精子尾部成像模糊或变细。要用均匀的方式（如尖嘴塑料瓶）对称轻柔地冲洗2张涂片。

检测数据要经过95%可信区间检验

●可以通过WHO第5版推荐的统计学计算公式进行计算（先进的CASA 能够自动计算），进行两个样本均数差别的检验。

●将两次检查结果直接查表（WHO第5版表2-5，表2-1），判断差异是否可以接受。

●如果实验室的技术人员都经过严格的SOP培训，或使用能自动检验95%可信区间的CASA，在每天工作的始末，对第1份标本和最后

1份标本进行检验，是工作量太大的单位的一种简约式选择。

精液分析的IQC

精子浓度、活力和形态学等基本参数应该始终有内部质量控制

（IQC）的监控。执行IQC的实用方法是购买独立机构的商品化质控品。这些质控品不应该来自本身有临床任务的单位，以保证公正和确保产品有专门的企业标准、品质管理和质量控制的保障。这些质控品的靶值和已知变异范围应附报告，详细说明靶值的获得方式，每批次的数量、各自的编号、生产日期、有效期等信息。

男科实验室可用质控品标称的范围来评价自己工作的准确性。

浓度质控品：微球悬浮液

●微球悬浮液也称质控珠。可以配合计数板上的网格进行人工计数的培训。

●使用质控珠可以校验CASA对精子的捕捉功能，CASA的捕捉率应达 99%以上。质控珠不能判断CASA对杂质的误捕情况（对此应选用背景相对差的冷藏精液质控标本）。

●质控珠的标称浓度以25×10⁶/ml左右为宜。过高浓度的质控珠容易产生微球聚集的现象而影响浓度的准确性。

●定期（如一周一次）用质控珠对CASA的捕捉率进行校验，可同时调整使用相差显微镜时的习惯亮度、聚光镜的位置等，把达到最高捕捉率时的条件固定下来。

活力质控措施：视频录像

●人工分析精子活力可以采用WHO推荐的用摄像机拍摄视频录像，通过重复播放视频录像来重新评估精子的活力。

●越来越多的CASA采用了＞50帧的高速率步进式CCD，改变了拍摄多

幅照片再描绘精子运动轨迹的旧设计思路，软件的升级使新型

CASA具备了视频录像功能，可以实时记录精子的运动轨迹，永久储存，随时重复回放，创造了人工校验CASA活力分析质量的基本条件。

视频录像的分析

●在分析视频录像时，WHO推荐的方法是：将一个醋酯膜栅格覆盖在视频监视器上，模拟用显微镜分析时目镜中的栅格。

●实际上可以利用计数板上的精确的网格（1小格边长为0.1mm），

测量出显示屏上相应的长度，再按此比例制作网格胶片，覆盖在显示屏上，用彩色笔先确定不动精子，再确定前向运动精子，最后确定非前向运动精子。人工评估可以重复，也可以和CASA的分析结果进行比较。

形态学质控措施：网格定位片

●使用WHO推荐的网格定位玻片制作实验室的系列染色精子质控片，供重复使用确定操作人员或CASA的评估水准和准确性。

●购买独立机构生产的商品化的质控涂片，其制作过程有质量控制，定位精子都附有各参数的检测数据，可提高重复阅片的精确性，但要特别注意此种质控片的染色方法要和实验室的染色方法一致，且都有一定的保质期，需要定期更换。

●实验室在每天开始形态学检测工作时，首先阅读质控涂片，记录分析结果并与对应的标准数据进行比较，超出可信区间的结果要进行误差来源分析。

形态学质控措施：制作DVD

WHO第5版推荐制作DVD用于评估精子形态学，但只能是辅助方法而不能替代对精液样本的重复评估。

CASA也可以自带刻录软件，可以把每份标本储存的全部图像

都记录在DVD中，这种质控的方法不仅有利于图像的长期保存，更有利于培训或学术交流。这不仅是监督实验室形态学分析质量的方法，也是形态学外部质量控制的重要方法之一。

浓度与活力检测报告的规范

●要有一次射精的精子总数、前向运动精子总数等WHO第5版特别强调的参数指标。

●采用WHO第5版各参数的第5百分位数作为参数值下限。

●当检查的精子总数不足400条时要按计数的精子数报告取样误差的百分率。

●以重复抽样的经过差别统计学检验后的均值出报告。如果采用单次检测结果，应于注明。

●低于2×10⁶/ml的精子浓度若仅用于普通临床检测目的可以统一报告精子浓度＜ 2×10⁶/ml就足够了。

形态学检测报告的规范

●对异常精子的分类有非常重要的临床意义，各种形态学异常都应该有百分率统计报告。

●大多数CASA不能对精子尾部作出判断，需要人工补充评估或修正，没有尾部分析结果的报告是有重要缺陷的。

●推荐采用WHO第5版各参数的第5百分位数作为参数值下限。

●当检查的精子总数不足400条时要按计数的精子数报告取样误差的百分率。

●以重复抽样的经过差别统计学检验后的均值出报告。如果采用单次检测结果，应于注明。

制作Xbar(举例）

制作活力、形态学Xbar

?         除了定期用已知靶值的质控珠做浓度的监测外，用已知靶值的冷藏精液标本做浓度监测也是可行的方法。如果是使用CASA检测标本，则应先对CASA（包括计数板）的质量和性能进行检验，否则容易在“错误” 的基础上得出“在控”的结论而忽略了系统误差的存在。

?         活力和形态学的Xbar都是按百分率计算的，在统计学中已经详细介绍了。要注意的是：活力Xbar要以百分比最高的参数为目标，一般情况下是不动精子（IM）。由于异常精子形态种类繁多，目前尚无明确的参数阈值，所以形态学Xbar一般以正常精子形态的百分比为目标。

各实验室之间的外部质量控制

实验室的外部质量控制（EQC），在国外一般由独立的中心机构牵

头发放精液分析的质控样本，参加EQC的实验室需制定参与外部质量评价的程序，对质控样本的处理和保存、检测过程、结果报告时间等进行详细的规定，确保能够遵守EQC的要求。各实验室应采取与常规测试一样的程序检测该中心机构提供的样品，并实事求是地参与外部质量评价活动，如实回报检测结果。

独立的中心机构需客观地评价各实验室对发放的精液质控标本的检测结果，对数据的离群值进行检查并计算均值和标准差，从而对参与实验室的精液分析质量给出评价鉴定。

外部质量控制的目的

●外部质量控制（EQC）是监测分析结果的完整质控程序的一部分。

而外部质量保证（EQA）则监控着与样本收集和结果报告有关的所有实验室程序，以确保实验室程序在控。

●EQC可以评价各实验室精液常规分析的准确性，使实验室之间的结果得到比较，也能以一种在单个实验室无法实现的规模对不同方法进行评价和比较。

●EQC包括同行比较和能力验证程序。通过外部质量评价可以发现实验室存在的系统误差，得以纠正后便可明显提高精液分析的准确度。

实验室组织结构表（举例）

实验室工作人员岗位职责表（举例）

实验室工作记录表（举例）

实验室人员培训计划表（举例）

SOP手册（目录举例）

?         1.标本验收和保存的标准

2.精液标本的安全处理

?         3.精液黏稠度的评估

?         4.精液外观

?         5.精液pH值

?         6.显微镜初检

?         7..精确测量精子浓度与活力分析（CASA）

?         8.特殊精液标本的处理方法：

?         9. 实验报告的保存和发放

?         ……

质控品使用记录(举例）

微球悬浮液（质控品） 批号：购买日期     有效期

各种报告单汇总

仪器保管责任人一览表(举例）日期

染色液使用记录和更新记录表

技术人员Sbar汇总

EQC的参与条件尽可能一致

●EQC的评价程序：

根据作为组织者的中心实验室详细要求的标准操作程序进行，在执行前要比较原先执行的自行制定的SOP，对不符合要求的地方进行改进。

●按照自己的SOP去检测EQC中心的质控品是有缺陷的，因为不同的SOP无法进行可信、可重复的有价值的比较，除非是为检验不同方法专门设计的EQC项目。

IQC是EQC的前提

● 每个实验室必须先实行IQC，且认真执行“检查足够多的精子”和 “进行95%可信区间检验”的统计学原则，才有资格参加EQC，随便组织几个单位共同检测一种质控品的做法不是真正意义上的EQC,

至少不能给予参加单位有积极的反馈意见。

●EQC样本要按规定处理，如及时将检测几个报告给中心实验室等；

并要做好保存记录。

结语

?         我国开展精液分析项目的单位很多，但男科实验室开展精液分析

质量控制的却是一小部分。即使开展精液分析质控多年的实验室，很可能对照5版方法还有可以改进和提高的地方。

?         如同其他检验项目一样，精液分析的质量控制势在必行，虽然难度很大，但事关人口素质、种族繁衍、环境评估和毒理药理研究等，应该引起我们的充分重视。

谢谢

 

第二篇：公猪精液规范化采集与稀释

公猪采精

公猪采精与稀释操作规程

-----四川安佑技术服务部（2012-09-14）

1、采精与精液处理流程（讲究卫生，控制温度）

（1）采精过程流程

1、 进入实验室后清洁双手

2、 准备稀释液，并将稀释液放入35℃水浴锅中升温

3、 打开显微镜上的加热板控制开关，设定温度到38℃

4、 安装集精杯（预热到37℃），准备其它采精用品，放入壁厨

5、 将公猪赶入采精室，关上栅栏，清洁其体表

6、排出包皮液用0.1％KMnO4溶液清洗其腹部及包皮，再用清水洗净，抹干。 7、 戴上双层手套，诱导公猪爬跨假母猪

8、 锁定并拉出阴茎

9、 待排出部分清亮液体后，开始收集精液

10、将集精杯放入壁厨

11、将公猪赶回圈内

（2）精液处理操作流程

1．将一预温后的烧杯或塑料杯放在电子秤上，打开电子秤，当显示为零时，将装精液的食品袋从集精杯中取出放入杯中，显示读数为精液的重量。

2．将放精液的烧杯轻轻摇匀精液后，放入35℃的水浴锅中与稀释液等温。

3．立即用取样器取精液10～25微升左右，滴在载物台上预热的载玻片上，盖上盖玻片，估测活力。精子活力大于0.6，则可用于下一步的处理。

4．另取1毫升精液放入加有10毫升生理盐水的精子密度杯中，读出读数后，在查对表上查到精子密度值。

5．计算精液可分装的份数和最终的精液体积或重量。

6．将大烧杯放在电子秤上，除皮，然后再将精液袋放入其中，并将精液袋上口翻在杯沿外，将装稀释液的三角瓶从水浴锅中取出，擦去底部水分，将稀释液加入大烧杯中，直到达到计算的最终重量，轻轻摇动或用玻璃棒搅拌精液使其混合。

7、精液稀释后，检查精液活力，若无明显下降，开始分装。

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公猪采精

8．将精液按规定重量分装于各个精液瓶（袋）中，排出空气后封口，进行精液标记，置22℃-25℃的室温1小时后(或用几层毛巾包被好后)，降温到20℃左右时直接放置17℃冰箱中。

9．清洗各种容器并放于消毒柜中干燥消毒。

2、稀释液的配制过程

2.1 配制过程

以1000毫升BTS稀释液为例，可用任一方法：

①经过清洗干燥消毒的三角瓶，将一袋BTS稀释粉（50克）全部加入瓶中，用量筒量取双蒸馏水1000毫升，加入三角瓶中。盖上盖子或用稀释粉袋套在三角瓶口上，封紧摇动，使稀释粉完全溶解。或放在磁力搅拌器上，搅拌加速溶解。取下盖子，放入35℃的水浴锅中预温。

稀释液用过后，三角瓶应用蒸馏水冲洗，空干水分，然后将三角瓶、量筒用牛皮纸封口，放入80～120℃的消毒柜或干燥箱中烘干。

②将两个食品袋相套放入大烧杯中或塑料杯中，放在电子秤上，打开电子秤开关，当电子秤上读数为零时，

将连接蒸馏水容器的硅胶管放出少量水后，将管口对准杯口注水，并注意读数变化，当接近1000克时，应放慢流速，改为滴注，直到1000克。之后，应将蒸馏水管的龙头套好，防止污染。

在大烧杯中加入一袋稀释粉（50克）。

从盛磁珠的小烧杯中取镊子并夹取磁珠，在废液缸上用洗瓶冲洗磁珠2-3次， 待磁珠上水分滴净后，放入烧杯中，然后将烧杯放在磁力搅拌器上，打开电源开关和加热开关，调整磁珠转速旋扭，使磁珠以适当速度旋转（水体形成涡流），使稀释粉全部溶解后，降低磁珠转速，关闭加热和电源开关。

将杯子放入35℃的水浴中预温。

注：不能控温的加热磁力搅拌器使用时间不可超过10分钟，或及早关闭加热电源；平时磁珠放在一个清洗干燥过的小烧杯中，注入新鲜蒸馏水半杯，镊子为不锈钢材料，也经清洗干燥放入杯中，盖上干净的培养皿，每3周应换掉陈水， 2

公猪采精

冲净换上新的蒸馏水。稀释液加入精液中后，应用小烧杯中的镊子将磁珠从大烧杯中夹出，并在废液缸上冲洗磁珠和镊子前端3-4遍，待磁珠上水分滴净后，连同镊子放入小烧杯中，盖上培养皿。

这种方法由于稀释液是在一次性食品袋中配制的，因此，不需要对配制稀释液的容器进行清洗和消毒，实现了稀释液配制的免消毒。

冬季稀释粉溶解较慢，可将稀释粉与水混合后，放入水浴锅中预温10分钟，再摇匀，可加速稀释粉溶解。使用加热磁力搅拌器者不必在水浴锅中预温。

注：除大规模人工授精站外，一般不主张自己配制稀释粉，推荐使用商业化稀释粉，这些产品质量稳定可靠。另外，稀释粉与蒸馏水按什么比例混合是十分严格的，应按照说明书上的配比进行稀释粉的溶解，不可改变配比。

2.2 PH值与渗透压

用1N稀盐酸或1N氢氧化钠调整BTS稀释液的PH值为7.2(6.8-7.4)左右,渗透压为330mOsm

2.3 稀释液的保存

液态状稀释液冰箱4℃保存，不超过24小时，超过有效贮存期的变质稀释液应废弃。

3、采精前的准备

1.集精杯的准备应在实验室中进行。

用保温杯作集精杯时，不能直接将精液采入杯中。将两层食品袋装入保温杯内，并用洁净的玻璃棒使其贴靠在保温杯壁上，袋口翻向保温杯外，上盖一层专用过滤网，用橡皮筋固定，并使过滤网中部下陷3厘米，以避免公猪射精过快或精液过滤慢时，精液外溢。安装好后，将其放恒温箱在37℃温度下备用。

如果是纸杯作集精杯，在杯口上固定上一次性过滤网，并使网面下陷2～3厘米，

如果没有恒温箱，可在安装集精杯之前，用电吹风机将集精杯内壁加热到温热状态（不可加热到烫手）。

采精前应将集精杯、消毒纸巾、一次性手套放入壁厨中，以方便采精时取用。 3

公猪采精

2．精液品质检查用品准备 最好先将显微镜调好备用，把显微镜加热板放在显微镜载物台上，用标本夹固定好，打开电热板控制器电源开关，把设定温度调到38℃再打到测温状态，准备好两张洁净的载玻片和两张洁净的盖玻片放在加热板上预温。将电子秤、密度测定等用品准备好。

3． 公猪的准备

采精员将待采精的公猪赶至采精栏，关上采精区的栅栏门，并用毛刷刷拭假母猪的台面和后躯下；然后再清扫公猪两侧肋腹部及下腹部，必要时，可将公猪的阴毛剪短（留3厘米）。

4．采精员的准备

采精员应穿上工作服，将公猪赶入采精室后，清扫猪体后，应尽快右手戴上双层无毒的一次性手套，带上纸巾、集精杯、小凳准备采精。

4、采精技术

一、采精的目标与要求

1．用最简单的方法采集到全部含较多精子的精液

公猪性反射和射精特点与牛羊不同，其龟头对压力、约束力较为敏感，而对温度相对不敏感，因此公猪采用假阴道法采精效果往往不佳，而且猪射精时是分段射精的，一般不能收集最初射出的精液和清亮无精子的精液，因此，公猪适合用拳握法进行采精。这种方法既简单，又便于分段收集精液。

2．采集到的精液最大限度地不受到任何污染

由于采精过程中，公猪射精、收集精液都是在开放的环境中，精液极易受到污染。采精用的手套、集精杯、过滤网等与精液接触的物品必须无菌和对精子无毒害，一定要避免公猪体表及阴毛上的污物、包皮液、尿生殖道中的尿液、空气中的灰尘进入精液中。

3．尽可能使精液不受到外界温度的影响

公猪的精液对温度十分敏感，尤其是低温。因此，采精室的温度能够控制，不应低于10℃，最好在16-25℃之间，这不仅有利于公猪的性行为正常，而且能避免外界温度对精液温度的影响。

二、采精过程

1、 诱导公猪爬跨假母猪 采精员可摩仿发情母猪的叫声，并敲击假母猪诱导公猪爬跨。

2、在采精之前先剪去公猪包皮上的被毛，防止干扰采精及细菌污染

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公猪采精

2、排出包皮液。用0.1％KMnO4溶液清洗其腹部及包皮，再用清水洗净，抹干。公猪爬跨上假母猪后，采精员可坐公猪左后侧的小凳上，用右手按摩公猪包皮腔，尽可能将包皮腔中的包皮液（尿液）排净，并用纸巾拭干。

3、锁定公猪阴茎并将其拉出。 公猪阴茎勃起后，开始有试图插入母猪阴道的动作，但有些公猪伸出阴茎较慢，需要按摩包皮以帮助阴茎伸出。公猪阴茎伸出后，采精员应脱去外层手套，右手呈锥形的空拳，即拇指一侧较松，小指一侧较紧，拳心向上，使龟头（螺旋部分）进入空拳中，只让公猪的龟头伸出空拳1厘米左右，或不让其伸出拳外，用中指、无名指和小指锁定龟头，注意不要抓握阴茎体部（非螺放部分），以防造成公猪不适而从假母猪上退下，然后顺其向前冲力，将阴茎的“S”状弯曲尽可能地拉直，握紧阴茎龟头防止其旋转，公猪即可安静下来并开始射精；如果假母猪的结构合理，可将其阴茎向左前上拉，并使龟头向下弯，这样有利于防止包皮腔中的残存包皮液顺着阴茎流至集精杯。 “挤出包皮积尿，按摩公猪的包皮部，待公猪爬上假台猪后，用温暖清洁的手(有无手套皆可)握紧伸出的龟头，顺公猪前冲时将阴茎的"S"状弯曲拉直，握紧阴茎螺旋部的第一和第二摺，在公猪前冲时允许阴茎自然伸展，不必强拉。充分伸展后，阴茎将停止推进，达到强直、“锁定”状态，开始射精。射精过程中不要松手，否则压力减轻将导致射精中断。”

4、左手打开集精杯盖，取下上面的纸巾。

5、 精液收集 公猪开始射精后，不要立即收集，待公猪射出部分清亮的液体后，再开始收集含精多的部分，如果手中的胶状物较多，可隔着纸巾将胶状物擦除。

6、 在精液收集过程中，应尽可能根据公猪的射精特点，只收集含精丰富的部分，不要收集清亮的液体和胶状物。注意在采精过程中不要碰阴茎体，否则阴茎将迅速缩回。

7、 采精过程中，如果仍有包皮中的尿液顺阴茎流出，可先将龟头抬高，然后在射精间隙或只射出清亮液体时，放下集精杯，左手拿纸巾将其吸附，避免流入集精杯中。

8、 当公猪开始环顾四周时，说明公猪射精即将结束。可略松开龟头，以观察公猪反应，如果阴茎又开始转动，说明射精没有结束，应立即锁定龟头；如果阴茎软缩，说明射精结束，可结束采精。

8．采精后，小心地将集精杯上的过滤网去掉，防止其掉入集精杯中，将集精杯中集精袋束口，将袋口上部放在集精杯沿上，盖上集精杯盖，然后应看着公猪爬下假母猪。将精液放入采精室与实验室之间的壁厨内，然后将公猪赶回圈内。

5、精液的稀释

1．精液稀释的目的

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公猪采精

新采集的动物精液精子浓度高，而且温度较高，精子的代谢强度大，很快就产生大量的代谢产物，并使其自身的生命耗尽。即使很短的时间内，都可能因精子的代谢产物对精子产生毒害，而使精子保存时间缩短。而用合理的稀释液稀释精液，则可给精子提供营养，中和代谢产物，并且允许精液降温，从而大大延长精子的存活时间，并能保持精子的受精能力。所以，对人工授精来说，猪精液尽快进行稀释十分重要，这也是为什么要将实验室建在采精室的隔壁的原因。另外，原精液的精子浓度大，而一次输精的总精子数仅几十个亿，只相当于几毫升到十几毫升的原精，而母猪受精时需要的总精液量又不能低于100毫升，这也是必须稀释的另一个原因。因此，精液稀释的目的是：

（1）增加精液容量，以确保每头母猪输精的总精液量。

（2）有利于精子的体外存活和受精能力的保持。

猪精液的稀释液配方有很多种，如在常温下可保存3～5天的配方有BTS，Kiev、Modena等，保存5～7天的长效保存稀释液有ZorPVA。也有冷冻精液稀释液。

最常用的稀释液为BTS稀释液。

2．每份精液的总精子数

目前还没有一个每头份精液的最低精子数标准和体积标准，但一般认为一次输入15亿以上个精子，对受胎率和产仔数是可靠的。但也没有必要超过60亿个精子。

在实际生产中，建议刚刚开展人工授精的猪场，每份精液应有50～60亿个精子；如果人工授精人员技术已经熟练，可将每份精液总精子数降到40亿。而个体人工授精站每份精液的总精子数应在25～30亿。从精液的容量上讲，初配母猪一次输入精液量应为100毫升，经产母猪一次输精的精液量为120毫升。原精液的活力（大于0.6）必须合格。（1ml精液约为1克）

3．精液稀释相关数据的计算

原精液总精子数=原精液体积（或重量）×原精液精子浓度*活率（活率通常为0.9—1，考虑有畸形精子）

原精液可分装的份数=原精液总精子数÷每份精液的总精子数（通常40亿） （取整数部分，不按四舍五入，而是舍去小数点后面的数）

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公猪采精

原精液稀释后的最终体积（或重量）=可分装的份数×每份精液的体积（100或120ml）

最大稀释的倍数最好不超过原精液体积的10倍。

举例说明：某头公猪一次采精精液的重量为230ml（或克），经测定精子浓度为1.8亿/毫升（或克），规定每份精液的总精子数为40亿，体积为100毫升（或重量100克），计算原精液稀释后最终的体积或重量。（以重量计算）

总精子数=原精液体积（或重量）×原精液精子浓度=230×1.8= 230*1.8 =414亿（是不是还有个活力问题？414*活力）

原精液可分装的份数=原精液总精子数÷每份精液的总精子数=

414÷40==10.35份

实际按10份计算。

原精液稀释后的最终重量=可分装的份数×每份精液的重量=10×100=1000克（所需的稀释液为1000-230=770克）

稀释后总重量小于原精液量的10倍（即2300克），说明稀释倍数在正常范围内。

特殊情况：如果精子浓度很高，则可先进行5倍左右的稀释，摇匀后，过30分钟后，再将剩余的稀释液加入，混合均匀。两次稀释后，总稀释体积也不能超过原精液体积的15倍，但不推荐这样。

4．稀释过程

把空塑料杯或大烧杯放在电子秤上，除去皮重，然后将原精液从集精杯中提出，放入杯中，根据计算出的稀释后的最终重量，将与精液等温的稀释液缓缓加入杯中，直到重量达到最终稀释后总重量为至。如上例，原精液与稀释液的总重量应为1000克。稀释加入后，应轻轻摇动或用洁净的玻璃棒搅拌精液，使其混合均匀。

精液稀释要注意以下事项：

（1）精液和稀释液的温差应尽可能小或是在等温情况下进行稀释。 精液稀释关键是温度，在精液稀释前，必须使精液和稀释液尽可能等温，在温度下降到32摄氏度以前，两者的温度最多相差1℃。否则就可能对精子的活力产生不良影响。如果可能，在精液品质检查过程前，应将装精液的集精袋放入大烧杯，然后 7

公猪采精

将其放入同一个水浴锅中，待精液品质检查完毕，一般精液的温度与稀释液温度已经很接近了。但最好的办法是根据季节，实测采集精液的温度，以便在这个季节中，采精前，将水浴锅温度事先设定在合适的温度值上。

（2）应将稀释液加入精液中，而不应该相反。

（3）稀释液应尽量从低处沿杯壁流入装精液的大烧杯中，避免将稀释液从高处倒下，形成冲击。

6、精液的分装

精液的分装可以先稀释精液，再进行分装，也有先将鲜精根据每份的应加入的原精液量分装于精液容器中，再加入稀释液。但我们推荐第一种方法。

6.1 精液分装的体积

精液容器既是精液贮存的地方，又是输精时的容器。也就是说，分装时，是按每头母猪一次输精的剂量进行灌装的。精液容器种类不同，其容量也不同，一般可容纳的总体积为80毫升，100毫升，袋装精液往往能装到120毫升。从形状上可分袋装精液、瓶装精液、牙膏式管装精液等。最常用的是瓶装和袋装两种。

6.2、分装方法

瓶装精液较容易分装，一是它有盖，瓶口较大，二是它有刻度。将塑料杯或烧杯中上口翻卷到外壁的食品袋拉紧，然后将精液从杯嘴处向精液瓶中注入精液，直到达到相应刻度值。但是要注意，分装时精液瓶不能直接与桌面接触，下面应该垫有干燥的毛巾防止精液温度散失。

瓶装精液加至刻度线后，上部仍会有一定的空间，会存留空气，对精子保存不利，可先将精液瓶盖旋上半圈，然后，轻轻挤压精液瓶，使精液上升至瓶口处，旋紧瓶盖，这样精液瓶内基本上没有空气。

袋装精液分装时较为困难，如果购买昂贵的精液分装机，肯定大多数场、站不能接受。建议的分装方法是：一个有机玻璃架（分装架），顶上安装两个螺钉， 8

公猪采精

用来将精液袋的两孔挂在上面，在架上有两个有机玻璃孔或金属箍用来固定漏斗使漏斗的玻璃管插入精液袋中。将分装架连同漏斗、精液袋放在电子秤上，打开电子秤，除皮，然后将精液从漏斗口加入精液袋中。

当重量达到规定重量时，取下精液袋，放在热封口机上，排出空气后，封口。

6.3 标记与降温

稀释的精液分装后，应在输精瓶（袋）上贴上标签（也可用标记笔标记），注明分装日期、公猪号、品种、失效期。分装后，应将输精瓶（袋）放在泡沫塑料箱中，让其缓慢降温（在22—25℃环境温度下1小时左右），大约达到20-25℃时，将装有分装过的输精瓶（袋）放入17摄氏度（15～18℃）的恒温冰箱中保存。

7、猪精液的保存

1．保存温度不应低于15℃，不高于20℃，最佳保存温度为17℃

如果有条件应尽量使用恒温设备来保存精液，应注意不可将精液保存在普通冰箱中，因为普通冰箱冷藏室内最高温度为8℃，而猪的精液的最低保存温度不能低于14℃。也不宜将稀释后的精液保存在20℃以上的室温下，即使室温在16～20℃范围内，也最好不要求在这种环境中保存，因为室温日夜变化太大，除非24小时内就使用，否则不能在这种环境下保存。适当降低保存温度有利于延长精子的存活期，减少代谢产物对精子的伤害。但温度不可低于16℃，否则精子就会受到损伤。在各种动物中，猪的精子对温度的变化十分敏感，尤其是低温，其原因不详。猪的精子对较高保存温度（20～25℃）有一定的耐受力，如果保存时间在12小时内，精子活力不会受到什么影响。

我们推荐的保存温度是17℃，上下温差不超过2℃。

2．精液稀释分装后应尽可能在72小时内使用完

平时要有经常检查保存精液精子活力的习惯。

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公猪采精

如果保存时间超过48小时用前应进行活力检查，一般稀释液如果精液的保存时间超过72小时，就应废弃。应该注意的是，自精液被稀释分装保存开始，在有效的保存时间内，精子的受精能力是逐步下降的，尽管精液保存96小时，受胎率仍没有明显降低，但在72小时用完，受胎率是十分可靠的。

每天隔8—12小时将精液摇匀一次。 在精液保存中，精子会沉淀到底部，每天应由工作人员分两次轻轻摇动或上下翻转输精瓶（袋），使精液再次混合后再放入保温箱中。

3．精液保存的设备

（1）常规保存设备

一般应使用专用的恒温冰箱，它能够保证在气温较高时制冷降温，在气温较低时加热，在供电正常的情况下全天候使用，而恒温（培养）箱通常只能在气温较低的情况下使用，高于精液保存温度的气温，则保温箱无控温能力。精液的保存环境重点是温度，应尽可能使温度在合适的范围内，保存容器应使精液不受强光的影响。

没有全面开展人工授精的猪场，从其它场购回的精液，可存放在地窖中，地窖温度一般在15～25℃。可进行精液的短期存放，但在使用前应进行精子活力的检查。

（2）停电或冰箱故障的应急措施

猪的精子对低温十分敏感，因此，重点要防止精液温度过低。

如果恒温冰箱停电或出现故障，在适宜的室温条件下，即室温在15～25℃内变化，可不必采取特殊措施，因为这种室温下，对精液的短期存放不会有太大影响。停电时间如果不超过3小时，一般也不会有太大问题。但如果气温高于25℃或低于15℃，则需要进行特殊处理。在冬季可将热水袋或输液瓶充入50～70℃的热水用厚毛巾包好，放入冰箱中，使其缓慢散热；在夏季，则可用袋装冰块（可用普通冰箱制冰），同样用毛巾包好，放入冰箱中。每2小时观察一次箱内温度，使箱内温度在16～20℃之间，如果温度不合适，应调整水温或增减外部隔热材料的厚度，以控制散热或吸热的速度。

4、注意定期摇动

保存过程中要求每8—12小时将精液混匀一次,防止精子沉淀而引起死亡。 10

公猪采精

辅助知识

1、怎样调教公猪爬跨假母猪采精？

猪人工授精要求训练公猪爬跨假母猪，以方便采精。用活台猪采精不仅不方便，受母猪是否发情的影响，而且存在一定的生物安全性问题。调教的目的是诱导公猪正确地爬跨假母猪，并进行正常的采精。

1．调教公猪的方法

（1）公猪达到6个月龄后，一般都会有爬跨其它公猪、小母猪和一些物体的行为，这是公猪的一种特性。7个月龄开始，就可以考虑调教后备公猪爬跨假母猪采精。每天将假母猪赶进采精室，并防止公猪逃跑，敲（拍）击假母猪以诱导其爬跨，每次调教时间20分钟，一旦公猪爬跨上假母猪，采精人员应随时进行正确的采精，因此，调教公猪的人员必须采精技术十分熟练。如果公猪没有爬跨假母猪，应将公猪赶回，第二天再进行调教。

（2）如果想尽快调教成功，可将发情母猪尿或分泌物涂在假母猪的后部，然后让公猪与假母猪接触、熟悉，待其爬跨后从后侧上前采精

（3）有些公猪胆小或不爱活动，可用发情母猪尿涂在布上，当将公猪赶入采精室时，让公猪嗅闻，并逐步诱导其爬上假母猪。

（4）对采用以上方法调教不成功的公猪，可采用下面的方法：先将一头体格中等，发情旺盛的母猪赶入采精室，并在其背部搭上麻袋；然后将待调教的公猪赶入采精室，公猪会很快爬跨发情母猪，由两人将其抓耳拉下，公猪会再次爬跨，待其达到性高潮时，表现为急躁、呼吸急促，这时将公猪拉下后，马上用麻袋遮住公猪眼，赶走发情母猪，将麻袋搭在假母猪上，诱导公猪爬跨假母猪。

（5）对性欲较差的小公猪可先让其与发情旺盛的经产母猪进行2～3次本交，以激发其性欲，然后再调教其爬跨假母猪。

2．调教公猪爬跨假母猪应注意的事项

（1）要有足够的耐心 采精员的耐心是公猪调教成功的关键，不要期望一次调教就能成功；不要强迫公猪爬跨假母猪；不要将公猪长时间关在采精室；不要对公猪进行各种惩罚。否则，公猪对采精训练会产生厌恶，不愿进入采精室，调教难度会更大。如果第一次训练持续20～30分钟，公猪仍不爬跨假母猪，应将公猪赶回圈内，第二天再进行同样的训练。

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公猪采精

（2）采精室要能防止公猪逃跑。 待调教的公猪对采精室开始不熟悉，也不能理解采精员的意图，往往总想逃出采精室。只有经过一段时间熟悉后，才会积极探索周围环境，并尝试爬跨假母猪。

（3）谨慎接近公猪，保证安全。 一些性情急躁的小公猪可能会攻击人，特别是用发情母猪诱导其爬跨假母猪时，更易产生攻击人的行为。因此，一是不要离公猪的头部太近，二是不要对着看不见公猪的方向进行操作。

（4）必要时采精员亲自饲喂和管理待调教公猪。 建立人畜亲和关系是公猪调教的一个重要条件，在调教公猪前先由采精员对公猪进行一段时间的饲喂，并每天刷拭公猪体表，可以避免公猪对采精员产生好奇、恐惧、防御等行为，有利于接近公猪进行相应操作。

（5）公猪爬上假母猪后从后面靠近公猪，并轻轻按摩其包皮。 这样有利于激起性反射，并排出包皮液，便于采精。

（6）采精员必须操作熟练。 不正确的采精方法往往会造成公猪巨大的痛苦，特别是用手握住公猪阴茎体部（非螺旋部分），公猪会非常痛苦而从假母猪上退下来；在采精过程，如果锁定力度不合适，可会造成公猪的不舒适；采精过程龟头脱手也都会造成公猪痛苦；如果公猪爬跨上假母猪后，因不舒适而从假母猪上退下，那么会对今后调教成功的难度会增大，但即使如此，也不能急燥冒进，要吸取教训，审查操作过程以便在下一次调教中进行相应调整。即使已经成功采精几次的小公猪，如果采精方法不当，也会削弱已经建立起来的条件反射。所以，在公猪爬跨上假母猪后，熟练、准确的操作，对调教成功是十分重要的。

（7）采精成功后应在第二、三天同一时间重复一次 主要目的是巩固记忆，使公猪形成牢固的条件反射。

3．调教的年龄

不同品种的公猪的性成熟时间不同，调教的最佳时机也不同，一般6.5～7.5月龄的小公猪较好调教。夏季公猪性机能发育较慢，在6.5月龄时可能性欲并不旺盛，应适当推迟调教时间。夏季调教公猪，应选择每天清晨天气凉爽时进行。

2、采精室的设计与环境要求

1.采精室的温度控制 采精室的温度应控制在10～28℃之间。采精室最好是一个安装有空调的房间，以使公猪的性欲表现和精液不受影响。

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公猪采精

2.物品传递应方便。 采精室最好与处理精液的实验室只有一墙之隔，隔墙上安装一个两侧都能开启的壁厨，以便从实验室将采精用品传递到采精精室和采集的精液能尽快传递到实验室进行处理。

3.应有安全区。 公猪是非常危险的动物，在采精时，工作人员不能掉以轻心，采精室设计应考虑到采精员的安全。在距采精区距外门口80～100厘米处，设一道安全栏，用直径12厘米的钢管埋入地下，使高出地面70～75厘米 净间距28厘米，并安装一个栅栏门。这样就形成里边的采精区和外边的安全区，栅栏门打开时，使采精室与外门形成一个通道，让公猪直接进入采精区，而不会进入安全区。当公猪进入采精区后，将栅栏门关闭，可防止公猪逃跑。一旦公猪进攻采精员，采精员可以迅速进入安全区。另外，采精室最好有一个赶猪板，防止公猪进攻人时，采精员可用赶猪板将猪与人隔开，避免受到攻击。

4.假母猪。 假母猪的台面可用钢材、木材或塑料制成，一般用钢材作支撑使其与地面保持适当距离。也可从提供设备的公司定制钢制假母猪。假母猪在设计上应尽可能考虑到公猪爬跨时的舒适性，钢制假母猪冬季会较冷，如能在表面上喷塑，就会起到一定的隔热作用，木制假母猪台面便于加工，并能根据母猪的实际体型尽可能使假母猪的表面曲线接近，而且木制假母猪冬季不凉，便于清洁。木制假母猪可能会被公猪咬损，但一般并不影响使用。塑料或玻璃钢制的假母猪台面更好。假母猪的表面最好不要覆盖物品，因为这样易被公猪咬坏，另外，覆盖物容易藏物纳垢，在采精时，会污染集精杯。

5.地面。 采精室地面要略有坡度，以便进行冲刷，水泥地面不要提浆打光，以保持地面粗糙防公猪摔倒。

6.其它物品 。采精室还应配备一个水槽，防滑垫，水管、扫把、毛刷等用品，用来清扫冲刷地面。

3、采精中应注意的事项

（1）采精时间

不宜在公猪饥饿时采精，也不能在公猪饱食后立即采精，应在喂食后1.5～2个小时后采精

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公猪采精

（2）注意人畜安全

（1）采精员应注意安全，平时要善待公猪，不要强行驱赶，恐吓，以免引起公猪烦燥情绪和攻击行为；

（2）初次训练采精的公猪，应在公猪爬上假母猪后，再从后方靠近，并握住龟头，一旦采精成功，一般都能避免公猪的攻击行为；但如果更换新的采精员，就需要更加小心；

（3）平时仍应注意观察公猪的行为，并保持合适的位置关系，一旦公猪出现攻击行为，采精员应立刻逃至安全角；

（4）确保假母猪的牢固，并保证假母猪上没有会对公猪产生伤害的地方，如钢管制作的踏板不能有锋利的边角。

（3）要有耐心

因为采精可能花费8～20分钟。公猪射精完成前，不要放松阴茎，当采集含精较多的部分后就放松阴茎是不合适的。不要催促采精过程，否则会使公猪受挫而变得危险起来。

（4）采精频率要适当

应根据公猪每次射精的总精子数、公猪的年龄、每次采精的性欲表现、每次采精的射精量变化以及不成熟精子的比例，判断公猪的采精频率是否适当，并进行调整。最高采精频率为隔日一次，最好每3天采一次精。刚刚开始采精的小公猪（8个月龄）每5～7天采精一次，至15月龄后，每3天采一次。两岁的公猪可根据情况，允许每2天采精一次，但仍要注意观察公猪精液及性欲的各种变化。

健康公猪休息时间不得超过两周，以免发生配种障碍。若公猪患病，一个 月内不准使用。

（5）使公猪形成良好的条件反射

每次采精时间要固定，以形成良好的条件反射，最好在每天的9时到10时左右采精，夏季可提前到6～7时。当也应寻找公猪每次采精的最佳时间。

（6）注意精液卫生并防止精液温度急剧变化

（1）经常保持采精栏和假母猪的清洁干燥；

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公猪采精

（2）保持公猪体表卫生，采精前应将公猪的下腹部及两肋部污物清除，同时注意治疗公猪皮肤病如疥癣（驱虫），以减少采精时异物（碎屑）进入精液中。

（3）采精前尽可能将包皮腔中的尿液排净，如果包皮液（尿液）进入精液中，可使精子死亡，精液报废。如果前一天剩有稀释液，可装在输精瓶中预温到30～38℃，采精时，在收集精液前冲洗龟头，使龟头更洁净。

（4）寒冷季节集精杯要预温以避免精子受到冷应激。

（7）尽量只收集浓份精液

浓份精液经过稀释，精液容易长期在体外保存，而清亮的精液中含有激活精子代谢的成分，不利于精子保存，故应尽可能少收集。

4、猪人工授精实验室的设计

不论是大型的商业化或小型的家庭式的人工授精实验室，都要按最高的卫生标准设计实验室。

人工授精实验室的设计要求是：

1、人工授精实验室必须有相对稳定的环境，确保环境和精液不会受到微生物和化学的污染。

2、人工授精实验室最好与采精室隔壁并用一壁厨相通。

3、根据需要，设计实验室的面积，一般不低于10平方米。

4、实验室台面高70～80厘米，台宽60厘米。台面和靠台面的墙壁50厘米高，应用无辅射的浅色光面瓷片贴成。

5、实验室应安装空调，并能使室温保持在15～25℃，配备照明设施。

6、应根据精液处理的要求和所使用的设备，进行内部合理的布局，并安装带有接地线的插座约10个。

7、实验室应有大于10平方米的面积，并根据实验功能进行分区：（见图） 湿区——进行用品清洗、稀释液配制。

干区——进行精液品质检查。

分装区——进行精液的稀释、分装、标记和保存。

湿区—稀释液配制与用品清洗区：1.水槽 2.蒸馏水口瓶 3.稀释液配制用品：量筒、三角瓶 4.水浴锅 5.微电脑消毒柜

干区—精液品质检查区：6.消毒纸巾 7.显微镜恒温加热板控制器 8.电光源显微镜 9. 玻璃棒 10.精子密度杯 11.精子密度对照表 13. 取样器

分装区—精液稀释与分装：12. 塑料杯、稀释后精液 14.恒温冰箱 15.电子秤、袋装精液分装架与漏斗 16.采精记录 17.袋装精液封口机 18.分装精液标记标签 19. 临时存放分装精液的泡沫塑料箱

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公猪采精

5、猪人工授精实验室操作规范

人工授精实验室工作和人工授精操作一样，工作人员必须经过培训，并具有严格按照操作规程操作的素质，确保精子不受到危害，并能良好地进行保存。确保从实验室送出的每一份精液输精的可靠性和安全性。

人工授精实验室是进行稀释液的配制、采精用品的准备、精液品质检查、精液的稀释与保存、输精前准备等工作的场所，为了生产出优质的符合输精要求的精液，一定把好质量关，保证从实验室送出的每一袋精液的活力不低于0.6，72小时内活力不受影响。

1.实验室要求整洁、干净、卫生，每周彻底清洁一次；

2.非实验室工作人员在正常情况下不准进入实验室，采精员也不准进入实验室，如采精员同时兼任实验室工作，则每次进入实验室时要更换衣、鞋和洗手；

3.实验室工作人员每次进入实验室要更换衣、鞋，洗手，一般情况下实验室应有外间作为缓冲间，并在此更换衣、鞋；

4.各种电器设备应按其要求选择适当插座，除冰箱、精液保存用的恒温冰箱外，一般电器要求人走电断，干燥箱无人值守时，设定温度不应高于80℃，连续通电时间在3个小时以内；要求接地的电器均应安装接地线；

5.物品、器皿的清洗、消毒方法：所有接触用于输精的精液的器皿（除一次性用品外）应用对皮肤无危害性的易洗涤的清洁剂清洗，并用自来水冲净，再用蒸馏水冲洗三至四遍，空干水分。玻璃用品干燥温度为80～150℃。多次性输精器使用后，立即用清水冲洗，不得使用热水和任何洗涤剂，冲洗后，再用蒸馏水冲洗，最后用75%的乙醇冲洗，然后放入消毒柜中80～100℃消毒1小时。

6.稀释液的配制、精液检查、稀释、分装应按照人工授精操作规程进行。

7.所有接触精液的用品必须是干燥的，因为水分（低渗液）可杀死精子。

8.实验室仪器设备应保持清洁卫生：实验室内使用的仪器设备，如显微镜、干燥箱、水浴锅、17℃冰箱、37℃恒温板、电子天平等，必须保持清洁卫生，显微镜头每2周应用蒸馏水浸泡擦洗一遍，保持清洁。恒温冰箱内部应每月用软布擦拭一遍，以防滋生霉菌。

9.作为采精室与实验室之间的传递口的窗只有在传递物品时才能开启使用，并尽量缩短开启时间。

10．实验室地板、实验台保持干净清洁，每天清洁一至二次。

11.下班离开实验室前一定要检查电源、水龙头、窗是否关闭好，做到万无一失方可离开实验室，确保安全。

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公猪采精

6、公猪精液的质量评估

采精后应立即检查精液，没有必要每次对精子进行形态检查，但应对新公猪的最初几次射精进行形态检查。以后每个月检测一次形态。如果感觉这些工作专业性太强，可将精液样品送到相关的科研部 门进行精子形态检查。精液的常规检查包括精液的量、气味、色泽、活力和密度。

（1）精液的容量

通常一头公猪的射精量为150～250毫升，但范围可在50～500毫升之间。一般建议用电子秤称量精液的重量，由于猪的精液的比重为1.03接近于1，所以，

（2）气味

正常、纯净的精液只有一点腥膻味。气味异常的精液包括：（1）精液臊味很大，精液可能受包皮液污染；（2）精液有臭味，则可能混有脓液。气味异常的精液必须废弃。

（3）色泽

猪的精液呈浅灰白色到浓乳白色（见右图），而公猪刚射出的浓份精液则呈奶油色（略偏黄）。异常精液有血精（呈红色）、脓精（呈绿色），均应废弃。 17

公猪采精

（4）活力

活力是精液中前进运动的精子所占总精子数的百分比。

对精子活力评定，通常只能作估测，所以需要有一定经验的技术人员进行评定。显微镜载物台应在活力检查前预热到37～39℃，并把载玻片、盖玻片一起预热。用取样器取10或15ul精液（注意取样器的吸咀是一次性的，并用消毒纸巾擦净，再取样，以防污染精液），注在预热后的载玻片中间。并盖上盖玻片。盖盖玻片的方法是，先将盖玻片放在精液滴的左侧与载玻片形成一个角度，呈一个锐角，并向右移动盖玻片，盖玻片与精液接触时，再将盖玻片放下，这样可避免产生气泡，影响检查结果。盖上盖玻片可以在显微镜视野里看到一薄层的精子，视野清晰，避免因不同层精子的活力不同而使判断出现人为误差。

用100倍或400倍的显微镜来检测精子的活力，即判断视野中前进运动精子所占的比例。

活力5级评分方法是：

整个视野中有明显的大的运动波 很好 5分

出现一些运动波和精子成群运动 好 4分

出现成群运动 较好 3分

无成群运动，部分呈前进运动 一般 2分

只有蠕动 差 1分

无精子活动 0分

对稀释保存的精液，在进行精子活力评估时，一般采用十级制评分。即估测视野中前进运动精子的百分率，因为，稀释后的精液，精子的运动较容易看清，可根据前进运动精子和非前进运动精子的大致比例，来进行估计。例如，有70%的精子呈前进运动，则活力为0.7，以此类推。

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不论是原精液还是稀释保存的精液，如果在检查中精子的活力很差，应仔细检查每个环节，进行第二次检查，应注意吸咀、载玻片和盖玻片必须洁净，对精子无毒害，载玻片温度适宜。如果第二次检查仍很差，则精液必须废弃。

（5）精子的浓度（或密度）

精子的浓度是指单位体积精液所含的总精子数（通常为亿/ml）。

（1）血球计数板法浓度测定

精子的浓度可用血球计数板法进行测定：轻轻摇动精液，用微量移液器（取样器）取精液100微升，擦去外部精液，加入一次性试管中，用移液管吸取3%氯化钠溶液3.9毫升(即3900微升)加入精液中，混合均匀，原精液被稀释了40倍。

将血球计数板放在载物台上，加盖盖玻片，用取样器吸取25微升稀释后精液加入计数板与盖玻片之间的计算室中使计算室充满（见图）。放在显微镜下找到计算室，计数计算室内的总精子数，为了减少计数的工作量，可选择有代表性的五个中方格，如四角一中心，或斜对角线的五个方格（见图用红色框标记的中方格）计数精子。

为了避免计数精子时重复，应以精子的头数为准，对在格线上的精子，可依照数上不数下，数左不数右的原则，计数五个中方格中的总精子数。为计算室的一个中方格，在计数量，在右侧线和下端上的精子（为了识别，标记为白色）是不应进行计数的精子。

五个中方格总精子计数完后得出的结果，依下列公式进行计算原精子密度（此公式已被简化）：

精子密度（亿个/毫升）=五个中方格总精子数×0.02

血球计数板法是其它光学测定方法的基础，因为光学的度数是根据光学仪器的原理得出的，与精子密度并没有直接关系，必须有已知的密度值才能获得对照表。

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（2）分光光度计或精子密度计法

这种方法是采用光学仪器，根据精子浓度越高，透光率越低的原理进行精子浓度测定的。在440纳米可见光下，用加柠檬酸钠溶液的比色杯，按100%透过率作空白对照，然后在另一比色杯中加入等量的柠檬酸钠溶液，再加定量精液，混合均匀后，放入样本池，读出透光率读数。最后查精子密度查对表，查出精子浓度读数。有时提供的对照表是指稀释后精液的精子浓度，需根据稀释倍数，换算出原精液精子浓度。精子密度查对表是用先用血球计数板测出诺干个精液标准样本的精子浓度值，然后将其稀释成不同浓度梯度的样本，每个样本的精子浓度均可计算出，测出其透光率，然后制成透光率和精子浓度查对表。

（3）精子密度杯法

由郑州牧业工程高等专科学校张长兴老师发明的精子密度杯，可以很方便地进行猪精子密度的测定，而且设备简单，价格低廉。

将10毫升生理盐水加入精子密度杯，根据采集到精液的色泽，初步判断精子浓度的高低，可选择添加原精液0.5毫升、1毫升、2毫升任一个添加量，加入生理盐水中，对初学者来说，可不必选择原精液添加量，只需固定地添加1毫升量即可，只是测定值的精确度略低。用拇指压紧杯口，上下翻转4～5次， 然后在自然光或较强的光照下，将密度杯与眼呈水平，从上向下观察其读数值，再根据实际添加量，查对照表的相应的列，就可以查到原精液的精子浓度值。

（6）精子的形态观察（畸形率）

精子的形态观察主要是观察精子的畸形率，猪的精子畸形率不能超过20%，否则就必须废弃。

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（7）精子的凝集现象

与牛羊不同的是，猪的精子很容易发生凝集。当凝集严重时，精液在直观条件下就可看到精液很不均匀。轻度凝集，可在显微镜下观察到，精子成团存在，有些精子尽管在蠕动，但已经失去了前进运动的能力。精子凝集后，凝集的精子失去了活力，使精子活力总体上大幅度下降。因此，凡有轻度凝集的精液，如果活力符合要求，应注意作好记录，并在精液稀释后12小时进行活力检查，如果活力下降很明显，应考虑将精液废弃。活力0.7以上，有少量凝集，可用一个+号表示，有明显的成团精子凝集可用++表示，有大团凝集者为+++。有成团凝集的精液应废弃。

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7、猪精液的运输

1.短途运输

最常用的短途运输工具是泡沫塑料箱或疫苗箱。气候温和季节可将精液容器直接放入疫苗箱中运输；如果气温较高或较低（尤其是气温较低时），应用冰袋或热水袋放在疫苗箱底部，然后盖上小棉被，再将精液放入箱中，并放一支温度计，随时测量箱内的温度，力争使温度保存在16～20℃，但如果在短时间内输精，温度允许达到25℃，但不可低于16℃。极端寒冷地区在输精前可用热水袋将精液逐步升温到33℃左右，再用于输精，以防输精时，精液温度进一步下降。

2.长途运输或长时间运输

长途运输情况下，精液受外界温度影响程度较大，可采用专用车载冰箱存放精液。如果用疫苗箱或泡沫塑料箱存放应定时观察箱内温度。如果能保证车箱内合适的温度，则运输更安全，对存放容器的要求可以低些。

8、精液品质检查

本交公猪的精检原则：

（1） 所有在用的公猪每月必须普查精液品质一次，夏季每月两次，若连续三次精

检不合格或连续二次精检不合格且伴有睾丸肿大、萎缩、性欲低下、跛行等疾病时，必须淘汰。

（2） 精检不合格的公猪绝对不可以使用，公猪不够用采用人工授精

（3） 关于不合格公猪的复检工作，请按《五周四次精检法》进行复检。 《五周四次精检法》

（1） 首次精检不合格的公猪，7天后复检(第二次)。

（2） 复检不合格的公猪，10天后采精,作废，再隔4天后采精检查（第三次）。

（3） 仍不合格者，10天后再采精,作废，再隔 4 天后作第四次检查 。

经过连续五周四次精检，一直不合格的公猪建议作淘汰处理，若中途检查合格，视精液品质状况酌情使用。

公猪全份精液品质检查暂行标准

? 优：精液量250ML以上，活力0.8以上，密度3.0亿/ML以上，畸型率5%以下，感观正常。

? 良：精液量150ML以上，活力0.7以上，密度2.0亿/ML以上，畸型率 10% 22

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以下，感观正常。

? 合格：精液量100ML以上，活力0.6以上，密度0.8亿/ML以上 ， 畸型率18%以下(夏季订为20%)，感观正常。

? 不合格：精液量100ML以下且密度0.8亿/ML以下，活力0.6以下，畸型率18%以上(夏季订为20%)，感观正常。以上四个条件只要有一个条件符合即评为不合格。

四川安佑技术服务部提供 2012-09-14

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