薄层色谱层析

实验六薄层色谱层析

一、实验目的

1、学习 薄层色谱法的原理和方法；

2、学会利用薄层色谱分离提纯有机化合物的规范操作；

2、掌握比移值的计算方法；

3、了解比移值的影响因素。

二、实验原理

层析的基本原理：所有的层析系统都由互不相溶的两相组成，一个是固定相，另一个是流动相。利用混合物中各组分物理化学性质上的差异（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲合力、分配系数（是指在一定温度下达到平衡后溶质在两相中浓度的比值是一个常数）等），使各组分以不同程度分布在两相中，它们以不同的速度移动，最终彼此分开。

层析分类：柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱、 液相色谱

薄层色谱(thin layer chromatography)常用TLC表示，又称薄层层析，属于固－液吸附色谱。依其所采用的薄层材料性质和物理、化学原理的不同，可分为吸附薄层色谱、分配薄层色谱、离子交换薄层色谱和排阻薄层色谱等。

吸附薄层色谱采用硅胶、氧化铝等吸附剂铺成薄层，将样品以毛细管点在原点处，用移动的展开剂将溶质解吸，解吸出来的溶质随着展开剂向前移动，遇到新的吸附剂，溶质又会被吸附，新到的展开剂又会将其解吸，经过多次的解吸-吸附-解吸的过程，溶质就会随着展开剂移动。吸附力强的溶质随展开剂移动慢，吸附力弱的溶质随展开剂移动快，这样不同的组分在薄层板上就得以分离。

一个化合物在吸附剂上移动的距离与展开剂在吸附剂上移动的距离的比值称为该化合物比移值Rf

 

三、主要试剂和材料

蒽（A）、芴酮（B）、香草醛（C）及其混合物（D）；薄层层析硅胶G；薄玻璃板；环己烷：乙酸乙酯（5：1或6：1）；0.5%羧甲基纤维钠(CMC-Na)水溶液；毛细管(内径小于1mm)

四、实验装置

薄层色谱示意图

五、实验步骤

制板（简易平铺法）

（1）二块7.5cm×2.5cm玻片，洗净，控水。

取7.5cm×2.5cm载玻片2块，用去污粉搽洗，再用水淋洗，最后浸入无水乙醇中，取出晾干。取用时手指只可接触载玻片的边缘，不能接触载玻片两面。

（2）调糊：3g硅胶G和8mL0.5%羧甲基纤维素钠水溶液在小烧杯中搅匀。

在50 mL烧杯中，放入约3g硅胶，加入0.5%羧甲基纤维素钠水溶液8mL，调成糊状。

（3）铺层：用牛角匙将此糊状物倾倒于上述玻璃片上，用食指和拇指拿住玻璃片，做前后、左右振摇摆动，反复数次，使流动的糊状物均匀地铺在载玻片上。每组铺二块。

（4）活化：将已涂好硅胶G的薄层板放置在水平的长玻璃片上，室温放置0.5 h后，移入烘箱，缓慢升温至110 ℃，恒温0.5 h。取出稍冷放入干燥器中备用。

点样：

（1）画线——起始线和前沿线
　　（2）毛细管点样——斑点大小和斑点间间距。用内径小于1mm的毛细管取样品溶液，在距离薄层板底端8~10mm处，垂直地轻轻接触薄层板，斑点直径要小于2mm，一块薄层板可点2个样品，注意保持一定的距离，但斑点不能太靠边。

展开：展开剂选择；展开方法——倾斜上行法。取一有盖的广口瓶作色谱器，加入展开剂（用环己烷︰乙酸乙酯=3～5︰1），展开剂高度不要超过5mm，以免淹没斑点，然后将已点好样品的薄层板放入色谱器中，盖紧，等展开剂上升到接近薄层板上沿时，打开盖子，迅速用铅笔或小针在前沿作一记号取出，晾干。

显色：直接观察并量取a、b值，计算比移值。先用肉眼观察有无可见的斑点，然后放在紫外线分析仪下观察荧光斑点，并用小针轻轻勾划斑点的轮廓，最后放入盛有碘片的瓶中进行显色。

六、实验结果

 

第二篇：TLC(薄层层析色谱)技术原理与应用

TLC（薄层层析色谱）技术原理与应用

一、薄层层析（TLC）简介

薄层层析是将吸附剂或者支持剂（有时加入固化剂）均匀地铺在一块玻璃上，形成薄层。把欲分离的样品点在薄层上，然后用适宜的溶剂展开，使混合物得以分离的方法。由于层析在薄层上进行故而得名。

薄层层析是一种微量、快速的层析方法。它不仅可以用于纯物质的鉴定，也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定。还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。 根据分离的原理不同，薄层层析可以分为两类：用吸附剂铺成的薄层所进行的层析为吸附薄层层析，吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶；用纤维素粉、硅胶、硅藻土为支持剂铺成的薄层，属于分配薄层层析。

吸附TLC→固定相为吸附剂→氧化铝、硅胶。（较多用）

TLC→

分配TLC→固定相为液态（通常为水）→固定相吸附在支持剂上。

（一）吸附薄层的基本原理：

吸附薄层主要是利用吸附剂对样品中各成分吸附能力不同，及展开剂对它们的解吸附能力的不同，使各成分达到分离。

吸附作用主要由于物体表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德华力等产生。吸附强度决定于吸附剂的吸附能力，还受被吸附成分的性质影响，更与展开剂的性质有关。

1.吸附薄层层析：在硅胶薄层板上，样品中的两成分是两种结构近似的染料，在展开剂四氯化碳的作用下。在展开剂和薄层板之间不断地产生吸附、解吸，再吸附，再解吸，……。由于对氨基偶氮苯的极性比偶氮苯的极性稍强一些，层析的结果，对氨基偶氮苯受到的吸附作用稍强于偶氮苯，从而将两者分离。

展开结束以后，会在薄层板上形成两个斑点，混合物中的成分得以分离。

中药中的有效成分复杂多样，结构近似者不少。特别是对未知结构的成分分析，设计并摸索出合理的层析条件是首要任务。只有先设计出可用的层析条件，再经摸索改进，才可能对未知或者已知成分进行成功地分离。然后才能谈得上进一步的分析研究。

要设计出合理有效的层析条件，必须熟悉薄层层析条件的选择的基本要领。下面对薄层层析条件的选择做一初步介绍。

薄层层析的三项基本构成物质是：样品组分、吸附剂、展开剂。摸索层析条件，实际上是协调上述三者的关系，寻求一种能够有效分离样品组分的配合方案及实际操作要领。很明显，一切层析都是针对分析任务，也就是围绕待分离的样品组分来进行调整适应的。可见，层析条件的选择是以样品中的各组分为中心，适当调适展开剂的吸附剂的极性来实现的。

（二）薄层层析条件的选择：

1.概述：

吸附剂的选择：薄层层析用的吸附剂与其选择原则和柱层析相同。主要区别在于薄层层析要求吸附剂（支持剂）的粒度更细，一般应小于250目，并要求粒度均匀。用于薄层层析的吸附剂或预制薄层一般活度不宜过高，以Ⅱ～Ⅲ级为宜。而展开距离则随薄层的粒度粗细而定，薄层粒度越细，展开距离相应缩短，一般不超过10厘米，否则可引起色谱扩散影响分离效果。

展开剂的选择：薄层层析，当吸附剂活度为一定值时（如Ⅱ或Ⅲ级），对多组分的样品能否获得满意的分离，决定于展开剂的选择。中草药化学成分在脂溶性成分中，大致可按其极性不同而分为无极性、弱极性、中极性与强极性。

基本思路是根据待分离样品组分的极性来确定吸附剂的极性（类型、活化度）和展开剂的极性（主要溶剂、调节溶剂、辅助溶剂等）。要协调、处理好吸附剂、展开剂、及被分离成分三者之间的关系，才能得到理想的薄层层析结果。

2.吸附剂：

对吸附剂的基本要求是颗粒细致(薄层层析用的吸附剂与其选择原则和柱层析相同。主要区别在于薄层层析要求吸附剂/支持剂的粒度更细，一般应小于250目，并要求粒度均匀)、大

小均匀（亦即有较大的表面积和适当的吸附活性）；不能与样品组分、样品溶剂、展开剂发生化学反应；更不能与溶剂及展开剂发生溶解。（注：实际操作中，可通过选择不同的活化温度对吸附剂活性进行调节）。用于薄层层析的吸附剂或预制薄层一般活度不宜过高，以Ⅱ～Ⅲ级为宜。而展开距离则随薄层的粒度粗细而定，薄层粒度越细，展开距离相应缩短，一般不超过10厘米，否则可引起色谱扩散影响分离效果。

最常用的吸附剂是＿＿＿和＿＿＿＿。另外，市场上还有氧化镁、硅酸镁、碳酸镁、硅藻土、活性炭等。其中，只有活性炭是非极性吸附剂，其余均是极性吸附剂。它们对水和极性大的化合物吸附能力强。

（1） 氧化铝：

化学式为Al2O3，国产层析用氧化铝有碱性、中性、酸性三种，以中性氧化铝应用较广。 氧化铝的特点：

A: 氧化铝为吸附力较强的极性吸附剂，它适用于中性或者碱性的亲脂性化合物的分离。通常氧化铝的吸附能力与其自身的含水量有关。含水越多，吸附活性越小，吸附能力越小。氧化铝根据其含水量多少将其活性划分为五级。

B: 氧化铝的吸附能力与其自身的含水量有关

（2） 硅胶：

表达式为SiO2?XH2O。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基（－Si－OH），这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附。 特点：

A：硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。如对有机酸、挥发油、萜类、皂苷、黄酮、蒽醌、氨基酸等成分的分离适用，不能用于生物碱等碱性物质的分离。

B：硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。

由于结构的决定作用，氧化铝的活化温度可以很高（150℃－160℃），而硅胶的活化温度却不能太高（105℃－110℃）。一旦超过500℃，硅醇基会相互脱水而失活。

C：硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不能过高。

根据样品的酸碱性和极性大小确定了吸附剂以后，正确选择展开剂也是保证层析较好的分离的重要条件。

3. 展开剂：

展开剂：薄层层析中用来将样品展开的溶剂。

展开：用极性适当的溶剂浸润已经点了样品的薄层板一端，凭借毛细作用带动样品在薄层板上移动，最终使样品分离的操作过程。

展开剂常是由两种或者两种以上的溶剂铵一定的比例组成的溶剂系统。简称溶剂系统或展开所用的溶剂。“展开剂”＝“溶剂系统”＝“溶剂”；“展开”＝“展开过程”

4. 被分离成分：

被分离成分：分析任务所要完成分离的样品中的有效成分。

被分离成分的极性决定于其母核结构类型及官能团极性。如果吸附剂活性和展开剂活性固定不变的条件下，被分离成分的极性越大，吸附剂对其作用越强，展开距离越短；被分离成分极性越弱，吸附剂对其作用越大，展开距离越大。

一些基团的极性相对大小顺序已经在课本P31列出。

当然，具体物质的极性大小判断时，还要结合分子结构的具体情况进行判断。

总之，选择层析条件时，必须针样品中对被分离成分的极性，试行判断或确定吸附剂种类和活性，再探索配制展开剂。

在选择层析条件时，必须根据样品、展开剂、被分离物质三方面缩合考虑。

历史上吸附层析出现最早，是由俄国生物学家茨维特用碳酸钙作为固定相，石油醚作为流动相来分离植物色素的。除了吸附层析之外，另一经典的层析法是以液体作为固定相的液相层

析。液体固定相（多为水）被吸附在固态载体物质上，这些载体物质多是一种多孔性物质。这些液态固定相被载体固定在柱中，就成为液－液分配柱层析。

（三）分配薄层层析：

用极性溶剂吸苷在固体支持剂上所形成的混合物，铺成薄层（或装柱），然后活化、点样（或上样），再用极性较弱的展开剂（或洗脱剂）进行展开。

分配层析的一般原理：在展开过程中，各成分在固定相和流动相之间作连续不断的分配，由于各成分在两相间的分配系数不同，因而可以达到相互分离的目的。

以CS表示某成分在固定相中的浓度，Cm表示某成分在固定相中的浓度。则 分配系数：K＝CS/Cm

载体应该具备的基本条件：中性、多孔粉末、无吸附活性、在洗脱剂之中不溶解；所能够吸收固定相的量，最好能达载体本身重量的50%以上；能使流动相自由的通过载体所吸收的固定相，并且不改变溶剂系统的组成。能够满足这些条件的载体是硅胶、硅藻土、纤维素粉等。

分配层析所用的固定相一般为水及各种水溶液（酸、碱、盐与缓冲液）、甲酰胺、低级醇（亲水性）等。

分配层析所用的流动相选用与水不溶（或微溶）的有机溶剂。如石油醚、苯、卤代烷类、脂类、酮类（如丁酮）、醇类（丁醇、戊醇）等或者它们的混合物。

分配层析对混合物中各成分的分离，主要决定于各成分分配系数的差异，一般说来，对于种类成分均能适用，特别能适用于水溶性、亲水性物质而又稍能溶于有机溶剂中者。这样就恰好弥补了一般吸附层析（如氧化铝吸附层析适用于亲脂性物质）的不足。但是，由于分配柱层析样品处理量较少，因此，如能用吸附柱层析解决问题时，常优先使用氧化铝或硅胶吸附柱层析。

一般分配层析的条件可以由PC来摸索，再应用于分配柱层析。

（四） 薄层的制备：

1．基板的规格和构成：5×15㎝、5×20㎝、10×10㎝、20×20㎝大小的玻璃板或者不锈钢板、塑料板。

2．薄层板的分类：软板（制板时不加粘合剂）、硬板（制板时加入粘合剂）。

3．软板的制备：详见P32。

4．硬板的制备：详细演示、介绍手工铺板，了解薄层涂铺器的使用方法。

（五） 薄层层析的操作步骤：

1．点样：

A: 样品的溶解：将样品溶于展开剂极性相近、挥发性高的有机溶剂。

B: 薄层点样：用毛细管（0.5mm以下）或用专业点样器进行点样。

点样的要求：样点位置应在距离底边1-1.5cm处；点样量适当；样点直径小于2-3mm；间隔反复点样；多个样点时，间隔为2cm且处于同一条直线上。

经验做法：可先在PC或TLC点上不同量的样品，并展开、显色后观察分离情况，以此确定最佳样品用量。

2．展开：

当样点上的溶剂充分挥干后，将薄层放置在密闭容器中，使适当的展开剂从薄层的一端向另一端进行浸润展开的过程。

要求：密闭容器可选用层析缸、标本缸、标本筒等；展开方式有上行法、下行法之分，展开方向有单向、双向、多次展开等。详见P33。

注意事项：先悬空饱和、再入液展开；样点不能泡在展开剂中；薄层浸入时不能歪斜进入。

3．显色：

用适当的方法或者适当的显色剂处理薄层，使其上可能已经分离的各成分斑点显示出来，以方便计算各个斑点的比移值，从而提供定性与定量的依据。

显色的基本步骤是：一看、二照、三碘、四显，荧光背景也常见。详见P34。

4．比移值的计算与定性、定量：

展开结束后，经过各种显色操作后，样品中各个成分的斑点可能出现了不同程度的分离，为了表达各成分的相对位置（极性）通常以比移值作为称量斑点位置的指标。比移值的符号为Rf：

Rf＝(斑点中心与原始样点之间的距离)/(溶剂前沿与原始样点之间的距离)

注意事项：薄层层析的Rf 值受多种因素影响，即使严格按照实验要求做了，结果的重现性仍较差。因此，薄层定性时常与标准品一起点样进行对比分析。

二、展开剂的选择与常见溶剂的极性

（一）展开剂的选择：

在吸附薄层中，化合物在吸附薄层上移动的速度与展开剂的极性有关。展开剂的极性越大，化合物移动的速度越快，展开剂的极性越小，化合物的移动速度慢。

薄层层析要得到较好的展开效果，必须依据所要分离的样品来正确选择层析条件，对样品的极性进行认真研究，以确定及实验摸索适宜的吸附剂、展开剂。当吸附剂活度为一定值时（如Ⅱ或Ⅲ级），对多组分的样品能否获得满意的分离，决定于展开剂的选择。中草药化学成分在脂溶性成分中，大致可按其极性不同而分为无极性、弱极性、中极性与强极性。但在实际工作中，经常需要利用溶剂的极性大小，对展开剂的极性予以调整。

通常先用单一溶剂展开，根据被分离物质在薄层上的分离效果，进一步考虑改变展开剂的极性。Rf值最佳范围在0.3～0.5范围；可用范围在0.2～0.9。如果Rf较大可适量加入极性较小的溶剂，以降低展开剂极性。反之，加入极性大的溶剂。

（二）展开剂的极性

常用展开剂的极性次序可用溶剂的溶剂强度参数ε0来衡量。溶剂的ε0越大，极性越强，洗脱能力越强。反之越若。常用溶剂的极性如下：

溶剂 沸点 溶剂强度参数ε0 溶剂强度参数P` 选择性组别

异辛烷 99 0.01 0.1

正已烷 69 0.01 0.1

叔丁基甲醚 56 0.35 2.5 1

苯 81 0.32 2.7 7

乙醚 2.8 1

二氯甲烷 40 0.42 3.1 5

正丙醇 97 0.82 4.0 2

四氢呋喃 66 0.82 4.0 3

乙酸乙酯 77 0.58 4.4 6a

氯仿 61 0.40 4.1 8

二氧六环 101 0.56 4.8 6a

丙酮 0.66 5.1 6a

乙醇 0.88 4.3 2

醋酸 大 6.0 4

乙氰 0.65 5.8 6b

甲醇 0.95 5.1 2

水 很大 10.2 8

Snyder根据溶剂的极性p`分成选择性不同的八组，因此若某一溶剂作展开剂分离效果不好。则选择同组的另一种溶剂作展开剂就不会对色谱分离有明显的改变，而选择溶剂强度相同而选择性不同的组中的另一种溶剂可能改变色谱分离情况。

————文献来源何华，倪坤仪主编，自现代色谱分析，化工版2004.2第一版。

三）应用实例

1、药物及天然产物中的应用

根据本人的几年薄层层析经验，参考药典等国家药品标准和有关文献，将2000版药典一部里部分有代表性的对照品的薄层层实例按展开剂极性排序，并对其规律做一些分析。以下的分析和介绍是总体描述性的，目的是快速、简便地选择展开剂。如果想了解展开剂选择的各种理论，请参考其他专著。

选择展开剂，要依据溶剂极性和他们的混溶性，溶剂对被分析物的溶解性，以及被分析物的结构。这里只讨论药典里通常使用的以硅胶为固定相主体的正相薄层，也不考虑板的活性。 列出溶剂极性参数表，方便以下比较展开剂。环已烷:-0.2、石油醚（Ⅰ类，30~60℃）、石油醚（Ⅱ类，60~90℃）、正已烷:0.0、甲苯:2.4、二甲苯:2.5、苯:2.7、二氯甲烷:3.1、异丙醇:3.9、正丁醇:3.9、四氢呋喃:4.0、氯仿:4.1、乙醇:4.3、乙酸乙酯:4.4、甲醇:5.1、丙酮:5.1、乙腈:5.8、乙酸:6.0、水:10.2

于溶剂混溶性，一般根据相似相溶原则，需要注意，极性相差大的不混溶，比如正己烷与甲醇。多元展开剂，主体的两种溶剂不能混溶，就需要通过第三种溶剂来调和。比如：石油醚、正庚烷、正已烷、戊烷、环已烷和甲醇、水之类的。

一般正相色谱，固定相为极性，被分析物质的极性越大，需要极性更大的展开剂。 了解被分析物的极性可以通过分析其结构获得，很难获得它的极性指数。物质分子化学结构中，通常由较极性部分和非极性部分两部分。例如下面以苯丙烷为极性小部分，随着极性基团部分的增加，总体的极性就增加，展开剂极性也增加了。依次为肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、绿原酸。相应展开剂分别为：正己烷—乙醚—冰醋酸 (5:5:0.1)、苯－冰醋酸－甲醇(30:1:3)、氯仿－甲醇－甲酸（9:1: 0.5）、石油醚－乙酸乙酯－甲酸（3:6: 1）、醋酸丁酯－甲酸－水(7:2.5:2.5)。（由于薄层板、比移值不同的原因，展开剂极性比较是相对的，并非绝对的后者大于前者）。

现在最重要的问题是，不同化合物，怎么定它的极性，又用什么标准来定它对应的展开剂呢？

以下分开讨论不同化合物极性情况及其对应的展开剂。

（1） 极性较小的挥发性物质。

比如：冰片：石油醚 (30～60℃)—醋酸乙酯(17:3)、厚朴酚：苯－醋酸乙酯(9:1.5)、α-香附酮：苯－醋酯乙酯－冰醋酸(92:5:5)、丹皮酚：环己烷－醋酸乙酯(3:1)，这类化合物，以石油醚、正构烷和苯为体积百分数比较大的溶剂，通常起溶解和分离化合物的作用，而用醋酸乙酯为调节Rf（比移值）的溶剂。为了减少拖尾之类其他相似相溶原则以外的影响，适当加入添加剂，如有机酸或者有机碱。

（2）极性较小的不挥发性物质。

比如：β -谷甾醇：环己烷－醋酸乙酯－甲醇(6:2.5:1)或者环己烷－丙酮(5:2) 、熊果酸：甲苯－醋酸乙酯－冰醋酸(12:4:0.5)、齐墩果酸：氯仿－甲醇(40:1)、猪去氧胆酸：氯仿－乙醚－冰醋酸(2:2:1)、大黄素：苯—醋酸乙酯—甲醇(15:2:0.2)或者苯—乙醇 (8:1)、丹参酮ⅡA：苯-醋酸乙酯-甲酸(40:25:4) 、穿心莲内酯：氯仿-无水乙醇(9:1)、靛玉红、靛蓝氯仿－乙醇(9:1)或者苯－氯仿－丙酮(5:4:1)。这类物质展开剂极性比极性较小的挥发性物质洗脱力强一些，因为这类物质极性小的母核大，而极性大的基团通常可以形成氢键，比如羧酸、羟基。以上物质，母核分子量减小、母核结构中不饱和健的增加（尤其是出现苯环），极性基团的增加，都使极性增加，展开剂极性也增大。这个范围内的物质很多，一般展开剂大百分数的溶剂可以从环己烷—〉甲苯—〉二甲苯—〉苯—〉氯仿的顺序，按照极性要求选择。这里注意，异丙醇、正丁醇极性指数也比较小，在这范围的化合物很少用，因为粘性大、展开慢，造成斑点扩散；另外，羟基的氢键作用力也有不利。调节Rf值的溶剂，从醋酸乙酯—〉甲醇—〉丙酮—〉乙醇。挥发性物质也有很多带羰基、羟基的，但从它的挥发性就可以明白，分子间作用力不强，另外，母核与石油醚、正构烷和苯的结构差异小，估计更容易脱离硅胶吸附，更快进入溶剂中，而不需要通过提高展开剂的极性。

（3）皂苷类。

人参皂苷：氯仿－甲醇－水 (65:35:10)10℃以下放置的下层溶液或正丁醇－醋酸乙酯－水(4:1:5)的上层溶液或氯仿－醋酸乙酯－甲醇－水(15:40:22:10)10℃以下放置的下层溶液、芍药苷：氯仿－醋酸乙酯－甲醇－甲酸(40:5:10:0.2)、黄芩苷：醋酸乙酯－丁酮－醋酸－水

(10:7:5:3)、橙皮苷：苯—醋酸乙酯—甲酸—水(1:12:2.5:3)的上层溶液、葛根素：氯仿－甲醇－水(14:5:0.5)、芦丁：醋酸乙酯－甲酸－水(8:1:1)。这类物质，由于存在糖的多羟基结构，苷元的结构影响变小。展开剂中使用极性大的有机溶剂（氯仿、醋酸乙酯、甲醇、正丁醇）和水。乙酸和甲酸的使用，一方面增大展开剂极性，另外也可以抑制硅胶羟基的作用，减少拖尾。由于混溶性和硅胶耐酸能力的限制，水和酸的使用是有限度的。

（4）极性大的小分子有机酸。

没食子酸：氯仿－醋酸乙酯－甲酸 (5:4:1)、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、绿原酸、异绿原酸。这类物质多数是苯乙烯母核的，这个结构的极性本身比较大，另外有酚羟基和羧酸基团，个别有多羟基配基。皂苷的展开剂差不多，极性大。注意甲酸通常指的是浓度85%左右的，含有水。

（5）含氮有机物。

盐酸小檗碱：苯－醋酸乙酯－甲醇－异丙醇－浓氨试液(12：6：3：3：0.6)(氨蒸气饱和) 或正丁醇－冰醋酸-水(7:1:2)、麻黄碱：氯仿－甲醇－浓氨试液(20:5:0.5)或正丁醇－冰醋酸－水(8:2:1)、甘草酸铵：醋酸乙酯－甲酸－冰醋酸－水(15:1:1:2)。由于NH2硅醇基的作用很强，在强极性展开剂加有机酸、有机碱扫尾。对于极性化合物，使用正丁醇对斑点扩散影响较小，因为化合物和硅胶的作用强。

进行薄层分析基本可以根据母核、基团，选择相似的化合物对号入座。当然，具体的条件优化则需要根据实际情况了。遇到较困难的分离，需要使用到设计优化方法的，已经不属于本文讨论范围了。

2、有机合成中展开剂的选择

做有机合成时走板子是常有的事，展开剂的选择就至关重要了,选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷<己烷<苯<乙醚<THF<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的作用，常用的溶剂组合有：

Petroleumether/Ethylacetate, petroleumether/Acetone, Petroleumether/Ether,

Petroleumether/CH2Cl2, ethylacetate/MeOH, CHCl3/ethylacetate

展开剂的比例要靠尝试.一般根据文献中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。展开剂的选择条件：①对的所需成分有良好的溶解性；②可使成分间分开；③待测组分的Rf在0.2~0.8之间，定量测定在0.3～0.5之间；④不与待测组分或吸附剂发生化学反应；⑤沸点适中，黏度较小；⑥展开后组分斑点圆且集中；⑦混合溶剂最好用新鲜配制。一般来说，弱极性溶剂体系的基本两相由正己烷和水组成，再根据需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯来调节溶剂系统的极性，以达到好的分离效果，适合于生物碱、黄酮、萜类等的分离；中等极性的溶剂体系由氯仿和水基本两相组成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于蒽醌、香豆素，以及一些极性较大的木脂素和萜类的分离；强极性溶剂，由正丁醇和水组成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于极性很大的生物碱类化合物的分离。

很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果。我们在实验中，为了实现一个配体与其他杂质有效分离，曾经尝试了很多种的溶剂组合，最后才找到石油醚—EtOAc—HCOOH（5.5：3.5：0.1）混合溶剂。一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例（或者加入第三种溶剂）,达到最佳效果；如果没有分开的迹象（斑点较“拖”），最好是换溶剂。对于在硅胶中这种酸性物质上易分解的物质，在展开剂里往往加一点点三乙胺，氨水，吡啶等碱性物质来中和硅胶的酸性。（选择所添加的碱性物质，还必须考虑容易从产品中除去，氨水无疑是较好的选择。）分离效果的好坏和所用硅胶和溶剂的质量很有关系：不同厂家生产的硅胶可能含水量以及颗粒的粗细程度，酸性强弱不同，从而导致产品在某个厂家的硅胶中分离效果很好，但在另一个厂家的就不行。溶剂的含水量和杂质含量对分离效果都有明显的影响。温度，湿度对分离效果影响也很明显，在实验中我们发现有时同一展开条件，上下午的Rf截然不同展开剂的选择主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素来考虑在进行薄层层析时，首先应该知道未知化学成分的类型，其极性的大致归属，从提取液或从色谱柱的流动相极性可知，另外某样品里含多种化学成分先按极性不同大致分，然后细分，对于分离未知的化学物质，展开剂的选择也是一个摸索的过程，不应该仅仅从展开剂考虑，多因素综合衡量！

溶剂：层析过程中溶剂的选择，对组分分离关系极大。在柱层析时所用的溶剂（单一剂或混合溶剂）习惯上称洗脱剂，用于薄层或纸层析时常称展开剂。洗脱剂的选择，须根据被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑在用极性吸附剂进行层析时，当被分离物质为弱极性物质，一般选用弱极性溶剂为洗脱剂；被分离物质为强极性成分，则须选用极性溶剂为洗脱剂。如果对某一极性物质用吸附性较弱的吸附剂（如以硅藻土或滑石粉代替硅胶），则洗脱剂的极性亦须相应降低。

在柱层操作时，被分离样品在加样时可采用于法，亦可选一适宜的溶剂将样品溶解后加入。溶解样品的溶剂应选择极性较小的，以便被分离的成分可以被吸附。然后渐增大溶剂的极性。这种极性的增大是一个十分缓慢的过程，称为“梯度洗脱”，使吸附在层析柱上的各个成分逐个被洗脱。如果极性增大过诀（梯度太大），就不能获得满意的分离。溶剂的洗脱能力，有时可以用溶剂的介电常数（ε）来表示。介电常数高，洗脱能力就大。以上的洗脱顺序仅适用于极性吸附剂，如硅胶、氧化铝。对非极性吸附剂，如活性炭，则正好与上述顺序相反，在水或亲水住溶剂中所形成的吸附作用，较在脂溶性溶剂中为强。

3．被分离物质的性质：被分离的物质与吸附剂，洗脱剂共同构成吸附层析中的三个要素，彼此紧密相连。在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下，各个成分的分离情况，直接与被分离物质的结构与性质有关。对极性吸附剂而言，成分的极性大，吸附住强。

当然，中草药成分的整体分子观是重要的，例如极性基团的数目愈多，被吸附的住能就会更大些，在同系物中碳原子数目少些，被吸附也会强些。总之，只要两个成分在结构上存在差别，就有可能分离，关键在于条件的选择。要根据被分离物质的性质，吸附剂的吸附强度，与溶剂的性质这三者的相互关系来考虑。首先要考虑被分离物质的极性。如被分离物质极性很小为不含氧的萜烯，或虽含氧但非极性基团，则需选用吸附性较强的吸附剂，并用弱极性溶剂如石油醚或苯进行洗脱。但多数中药成分的极性较大，则需要选择吸附性能较弱的吸附剂（一般Ⅲ～Ⅳ级）。采用的洗脱剂极性应由小到大按某一梯度递增，或可应用薄层层析以判断被分离物在某种溶剂系统中的分离情况。此外，能否获得满意的分离，还与选择的溶剂梯度有很大关系。现以实例说明吸附层析中吸附剂、洗脱剂与样品极性之间的关系。如有多组分的混合物，象植物油脂系由烷烃、烯烃、舀醇酯类、甘油三酸醋和脂肪酸等组份。当以硅胶为吸附剂时，使油脂被吸附后选用一系列混合溶剂进行洗脱，油脂中各单一成分即可按

其极性大小的不同依次被洗脱。

又如对于C-27甾体皂甙元类成分，能因其分字中羟基数目的多少而获得分离：将混合皂甙元溶于含有5％氯仿的苯中，加于氧化铝的吸附柱上，采用以下的溶剂进行梯度洗脱。如改用吸附性较弱的硅酸镁以替代氧化铝，由于硅酸镁的吸附性较弱，洗脱剂的极牲需相应降低，亦即采用苯或含5％氯仿的苯，即可将一元羟基皂甙元从吸附剂上洗脱下来。这一例子说明，同样的中草药成分在不同的吸附剂中层析时，需用不同的溶剂才能达到相同的分离效果，从而说明吸附剂、溶剂和欲分离成分三者的相互关系。

3、薄层色谱在中草药中的应用

薄层层析是一种简便、快速、微量的层析方法。一般将柱层析用的吸附剂撒布到平面如玻璃片上，形成一薄层进行层析时一即称薄层层析。其原理与柱层析基本相似。

（1）薄层层析的特点：薄层层析在应用与操作方面的特点与柱层析的比较。

（2）吸附剂的选择：薄层层析用的吸附剂与其选择原则和柱层析相同。主要区别在于薄层层析要求吸附剂（支持剂）的粒度更细，一般应小于250目，并要求粒度均匀。用于薄层层析的吸附剂或预制薄层一般活度不宜过高，以Ⅱ～Ⅲ级为宜。而展开距离则随薄层的粒度粗细而定，薄层粒度越细，展开距离相应缩短，一般不超过10厘米，否则可引起色谱扩散影响分离效果。

（3）展开剂的选择：薄层层析，当吸附剂活度为一定值时（如Ⅱ或Ⅲ级），对多组分的样品能否获得满意的分离，决定于展开剂的选择。中草药化学成分在脂溶性成分中，大致可按其极性不同而分为无极性、弱极性、中极性与强极性。但在实际工作中，经常需要利用溶剂的极性大小，对展开剂的极性予以调整。

（4）特殊薄层：针对某些性质特殊的化合物的分离与检出，有时需采用一些特殊薄层。

① 荧光薄层：有些化合物本身无色，在紫外灯下也不显荧光，又无适当的显色剂时，则可在吸附剂中加入荧光物质制成荧光薄层进行层析。展层后置于紫外光下照射，薄层板本身显荧光，而样品斑点处不显荧光，即可检出样品的层析位置。常用的荧光物质多为无机物。其

一是在 254nm紫外光激发下显出荧光的，如锰激洁的硅酸锌。另一种为在365nm紫外光激发下发出荧光的，如银激化的硫化锌硫化镐。

② 络合薄层：常用的有硝酸银薄层，用来分离碳原子数相等而其中C一C双键数目不等的一系列化合物，如不饱和醇、酸等。其主要机理是由于C一C键能与硝酸银形成络合物，而饱和的C一C键则不与硝酸银络合。因此在硝酸银薄层上，化台物可由于饱和程度不同而获得分离。层析时饱和化合物由于吸附最弱而Rf最高，含一个双键的较含两个双键的Rf值高，含一个三键的较含一个双键的Rf值高。此外，在一个双键化台物中，顺式的与硝酸银络合较反式的易于进行。因此，还可用来分离顺反异构体。

③ 酸碱薄层和PH缓冲薄层：为了改变吸附剂原来的酸碱性，可在铺制薄层时采用稀酸或稀碱以代替水调制薄层。例如硅胶带微酸性，有时对碱性物质如生物碱的分离不好，如不能展层或拖尾，则可在铺薄层时，用稀碱溶液0.1～0．5NNa0H溶液制成碱性硅胶薄层。例如猪屎豆碱在以硅胶为吸附剂时，以氯仿-丙酮一甲醇（8：2：1）为展开剂Rf＜0．1，采用碱性硅胶薄层用上述相同展开剂，Rf值增至0．4左右。说明猪屎豆碱为--碱性生物碱。

（5）应用：薄层层析法在中草药化学成分的研究中，主要应用于化学成分的预试、化学成分的鉴定及探索柱层分离的条件。

用薄层层析法进行中草药化学成分预试，可依据各类成分性质及熟知的条件，有针对性地进行。由于在薄层上展层后，可将一些杂质分离，选择性高，可使预试结果更为可靠。

（6）中草药中的应用

以薄层层析法进中草药化学成分鉴定，最好要有标准样品进行共薄层层析。如用数种溶剂展层后，标准品和鉴定品的Rf值、斑点形状颜色都完全相同，则可作初步结论是同一化合物。但一般需进行化学反应或红外光谱等一种仪器分析方法加以核对。

用薄层层析法探索柱层分离条件，是实验室的常规方法。在进行柱层分离时，首先考虑选用何种吸附剂与洗脱剂。在洗脱过程中各个成分将按何种顺序被洗脱，每一洗脱液中是否为单一成分或混合体，均可由薄层的分离得到判断与检验。通过薄层的预分离，还可以了解多组分样品的组成与相对含量。如在薄层上摸索到比较满意的分离条件，即可将此条件用于干柱层析。但亦可以将薄层分离条件经适当改变，转至一般往层所采用洗脱的方式进行制

备柱分离。利用薄层的预分离寻找柱层的洗脱条件时,假定在薄层上所测得的Rf值一样品在柱层中的比移率（R）。这是由于在薄层展开时，薄层固定相中所含的溶剂经过不断的蒸发，而使薄层上各点位置所含的溶剂量是不等的，靠近起始线的含量高于薄层的前沿部分。但若严格控制层析操作条件，则可得到接近真实的Rf值。用薄层进行某一组分的分离，其Rf值范围，一般情形下为0．85＞Rf＞0．05。此外，薄层层析法亦应用于中草药品种、药材及其制剂真伪的检查、质量控制和资源调查，对控制化学反应的进程，反应副产品产物的检查，中间体分析，化学药品及制剂杂质的检查，临床和生化检验以及毒物分析等，都是有效的手段。

选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷<己烷<苯<乙醚<THF<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的作用，常用的溶剂组合有

Petroleumether/Ethylacetate, petroleumether/Acetone, Petroleumether/Ether,

Petroleumether/CH2Cl2, ethylacetate/MeOH,

CHCl3/ethylacetate

展开剂的比例要靠尝试.一般根据文献中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。展开剂的选择条件：①对的所需成分有良好的溶解性；②可使成分间分开；③待测组分的Rf在0.2~0.8之间，定量测定在0.3～0.5之间；④不与待测组分或吸附剂发生化学反应；⑤沸点适中，黏度较小；⑥展开后组分斑点圆且集中；⑦混合溶剂最好用新鲜配制。

一般来说，弱极性溶剂体系的基本两相由正己烷和水组成，再根据需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯来调节溶剂系统的极性，以达到好的分离效果，适合于生物碱、黄酮、萜类等的分离；中等极性的溶剂体系由氯仿和水基本两相组成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于蒽醌、香豆素，以及一些极性较大的木脂素和萜类的分离；强极性溶剂，由正丁醇和水组成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于极性很大的生物碱类化合物的分离。 很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果。

我们在实验中，为了实现一个配体与其他杂质有效分离，曾经尝试了很多种的溶剂组合，最后才找到石油醚—EtOAc—HCOOH（5.5：3.5：0.1）混合溶剂。一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例（或者加入第三种溶剂）,达到最佳效果；如果没有分开的迹象（斑点较“拖”），最好是换溶剂。对于在硅胶中这种酸性物质上易分解的物质，在展开剂里往往加一点点三乙胺，氨水，吡啶等碱性物质来中和硅胶的酸性。（选择所添加的碱性物质，还必须考虑容易从产品中除去，氨水无疑是较好的选择。）分离效果的好坏和所用硅胶和溶剂的质量很有关系：不同厂家生产的硅胶可能含水量以及颗粒的粗细程度，酸性强弱不同，从而导致产品在某个厂家的硅胶中分离效果很好，但在另一个厂家的就不行。溶剂的含水量和杂质含量对分离效果都有明显的影响。温度，湿度对分离效果影响也很明显，在实验中我们发现有时同一展开条件，上下午的Rf截然不同展开剂的选择主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素来考虑在进行薄层层析时，首先应该知道未知化学成分的类型，其极性的大致归属，从提取液或从色谱柱的流动相极性可知，另外某样品里含多种化学成分先按极性不同大致分，然后细分，对于分离未知的化学物质，展开剂的选择也是一个摸索的过程，不应该仅仅从展开剂考虑，多因素综合衡量！

溶剂：层析过程中溶剂的选择，对组分分离关系极大。在柱层析时所用的溶剂（单一剂或混合溶剂）习惯上称洗脱剂，用于薄层或纸层析时常称展开剂。洗脱剂的选择，须根据被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑在用极性吸附剂进行层析时，当被分离物质为弱极性物质，一般选用弱极性溶剂为洗脱剂；被分离物质为强极性成分，则须选用极性溶剂为洗脱剂。如果对某一极性物质用吸附性较弱的吸附剂（如以硅藻土或滑石粉代替硅胶），则洗脱剂的极性亦须相应降低。

在柱层操作时，被分离样品在加样时可采用于法，亦可选一适宜的溶剂将样品溶解后加入。溶解样品的溶剂应选择极性较小的，以便被分离的成分可以被吸附。然后渐增大溶剂的极性。这种极性的增大是一个十分缓慢的过程，称为“梯度洗脱”，使吸附在层析柱上的各个成分逐个被洗脱。如果极性增大过诀（梯度太大），就不能获得满意的分离。溶剂的洗脱能力，有时可以用溶剂的介电常数（ε）来表示。介电常数高，洗脱能力就大。以上的洗脱顺序仅适用于极性吸附剂，如硅胶、氧化铝。对非极性吸附剂，如活性炭，则正好与上述顺

序相反，在水或亲水住溶剂中所形成的吸附作用，较在脂溶性溶剂中为强。

3．被分离物质的性质：被分离的物质与吸附剂，洗脱剂共同构成吸附层析中的三个要

素，彼此紧密相连。在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下，各个成分的分离情况，直接与被分

离物质的结构与性质有关。对极性吸附剂而言，成分的极性大，吸附住强。 当然，中草药成分的整体分子观是重要的，例如极性基团的数目愈多，被吸附的住能就

会更大些，在同系物中碳原子数目少些，被吸附也会强些。总之，只要两个成分在结构上存

在差别，就有可能分离，关键在于条件的选择。要根据被分离物质的性质，吸附剂的吸附强

度，与溶剂的性质这三者的相互关系来考虑。首先要考虑被分离物质的极性。如被分离物质

极性很小为不含氧的萜烯，或虽含氧但非极性基团，则需选用吸附性较强的吸附剂，并用弱

极性溶剂如石油醚或苯进行洗脱。但多数中药成分的极性较大，则需要选择吸附性能较弱的

吸附剂（一般Ⅲ～Ⅳ级）。采用的洗脱剂极性应由小到大按某一梯度递增，或可应用薄层层

析以判断被分离物在某种溶剂系统中的分离情况。此外，能否获得满意的分离，还与选择的

溶剂梯度有很大关系。现以实例说明吸附层析中吸附剂、洗脱剂与样品极性之间的关系。如

有多组分的混合物，象植物油脂系由烷烃、烯烃、舀醇酯类、甘油三酸醋和脂肪酸等组份。

当以硅胶为吸附剂时，使油脂被吸附后选用一系列混合溶剂进行洗脱，油脂中各单一成分即

可按其极性大小的不同依次被洗脱。

又如对于C-27甾体皂甙元类成分，能因其分字中羟基数目的多少而获得分离：将混合皂甙

元溶于含有5％氯仿的苯中，加于氧化铝的吸附柱上，采用以下的溶剂进行梯度洗脱。如改

用吸附性较弱的硅酸镁以替代氧化铝，由于硅酸镁的吸附性较弱，洗脱剂的极牲需相应降低，

亦即采用苯或含5％氯仿的苯，即可将一元羟基皂甙元从吸附剂上洗脱下来。这一例子说明，

同样的中草药成分在不同的吸附剂中层析时，需用不同的溶剂才能达到相同的分离效果，从

而说明吸附剂、溶剂和欲分离成分三者的相互关系。

三、显色方法

（一）. 概述

一看、二照、三碘、四显，荧光背景也常见

A: 首先在日光下观察，划出有色物质的斑点位置

B: 在紫外灯下观察有无暗斑或荧光斑点

C: 大部分有机物会吸附碘可逆的产生棕色或黄色斑点。

D: 荧光薄板检测，观察荧光薄板中出现的暗斑。

E: 既无色又无紫外吸收的物质，可以用显色剂显色

显色剂可以分成两大类：一类是检查一般有机化合物的通用显色剂；另一类是根据化合物分类或特殊官能团设计的专属性显色剂。

（二）．通用显色剂

硫酸常用的有四种溶液：硫酸-水(1：1)溶液；硫酸-甲醇或乙醇(1：1)溶液；1.5mol／L硫酸溶液与0.5-1.5mol／L硫酸铵溶液，喷后110℃烤15min，不同有机化合物显不同颜色。 ②0.5％碘的氯仿溶液 对很多化合物显黄棕色。

③中性0.05％高锰酸钾溶液 易还原性化合物在淡红背景上显黄色。

④碱性高锰酸钾试剂 还原性化合物在淡红色背景上显黄色。

溶液I：1％高锰酸钾溶液；溶液Ⅱ：5％碳酸钠溶液；溶液I和溶液Ⅱ等量混合应用。

⑤酸性高锰酸钾试剂 喷1.6％高锰酸钾浓硫酸溶液(溶解时注意防止爆炸)，喷后薄层于180℃加热15～20min。

⑥酸性重铬酸钾试剂 喷5％重铬酸钾浓硫酸溶液，必要时150℃烤薄层。

⑦5％磷钼酸乙醇溶液 喷后120℃烘烤，还原性化合物显蓝色，再用氨气薰，则背景变为无色。

⑧铁氰化钾-三氯化铁试剂 还原性物质显蓝色，再喷2mol／L盐酸溶液，则蓝色加深。

溶液I：1％铁氰化钾溶液；溶液Ⅱ：2％三氯化铁溶液；临用前将溶液I和溶液Ⅱ等量混合。

（三）. 专属性显色剂

由于化合物种类繁多，因此专属性显色剂也是很多的，现将在各类化合物中最常用的显色剂列举如下：

(1)烃类

①硝酸银／过氧化氢

检出物：卤代烃类。

溶液：硝酸银O.1g溶于水lml，加2-苯氧基乙醇lOOml，用丙酮稀释至200ml，再加30％过氧化氢1滴。

方法：喷后置未过滤的紫外光下照射；

结果：斑点呈暗黑色。

②荧光素／溴

检出物：不饱和烃。

溶液：I．荧光素0.1g溶于乙醇lOOml；

Ⅱ．5％溴的四氯化碳溶液。

方法：先喷(I)，然后置含溴蒸气容器内，荧光素转变为四溴荧光素(曙红)，荧光消失，不饱和烃斑点由于溴的加成，阻止生成曙红而保留荧光，多数不饱和烃在粉红色背景上呈黄色。 ③四氯邻苯二甲酸酐

检出物：芳香烃。

溶液：2％四氯邻苯二甲酸酐的丙酮与氯代苯(10：1)的溶液。

方法：喷后置紫外光下观察。

④甲醛／硫酸

检出物：多环芳烃。

溶液：37％甲醛溶液O.2ml溶于浓硫酸l0ml。

(2)醇类

①3，5一二硝基苯酰氯

检出物：醇类。

溶液：I．2％本品甲苯溶液；

Ⅱ．0.5％氢氧化钠溶液；

Ⅲ．O.002％罗丹明溶液。

方法：先喷(I)，在空气中干燥过夜，用蒸气薰2min，将纸或薄层通过试液(Ⅱ)30s，喷水洗，趁湿通过(Ⅲ)15s，空气干燥，紫外灯下观察。

②硝酸铈铵

检出物：醇类。

溶液：I．1％硝酸铈铵的0.2mol／L硝酸溶液；

Ⅱ．N,N-二甲基-对苯二胺盐酸盐1.5g溶于甲醇、水与乙酸(128m1+25m1+1．5m1)混合液中，用前将(I)与(Ⅱ)等量混合。喷板后于105oC加热5min。

③香草醛／硫酸

检出物：高级醇、酚、甾类及精油。

溶液：香草醛1g溶于硫酸lOOml。

方法：喷后于120oC加热至呈色最深。

④二苯基苦基偕肼 ’

检出物：醇类、萜烯、羰基、酯与醚类。

溶液：本品15mg溶于氯仿25ml中。

方法：喷后于110oC加热5～lOmin。

结果：紫色背景呈黄色斑点。

(3)醛酮类

①品红／亚硫酸

检出物：醛基化合物。

溶液：I．0.01%品红溶液，通入二氧化硫直至无色；

Ⅱ．0.05mol／L氯化汞溶液；

Ⅲ．O.05mol／L硫酸溶液。

方法：将I、Ⅱ、Ⅲ以1：1：10混合，用水稀释至l00m

②邻联茴香胺

检出物：醛类、酮类。

溶液：本品乙酸饱和溶液。

③2，4-二硝基苯肼

检出物：醛基、酮基及酮糖。

溶液：I．0.4％本品的2mol／L盐酸溶液；

Ⅱ．本品O.1g溶于乙醇l00ml中，加浓盐酸lml。

方法：喷溶液I或Ⅱ后，立即喷铁氰化钾的2mol／L盐酸溶液。

结果：饱和酮立即呈蓝色；饱和醛反应慢，呈橄榄绿色；不饱和羰基化合物不显色。 ④绕丹宁

检出物：类胡萝卜素醛类。

溶液：I．1%～5%绕丹宁乙醇溶液；

Ⅱ．25%氢氧化铵或27%氢氧化钠溶液。

方法：先喷溶液I，再喷溶液Ⅱ，干燥。

(4)有机酸类

①溴甲酚绿

检出物：有机酸类。

溶液：溴甲酚绿0.1g溶于乙醇500ml和0.1mol/L氢氧化钠溶液5ml。 方法：浸板。

结果：蓝色背景产生黄色斑点。

②高锰酸钾／硫酸

检出物：脂肪酸衍生物。

溶液：见通用显色剂酸性高锰酸钾。

③过氧化氢

检出物：芳香酸。

溶液：0.3%过氧化氢溶液。

方法：喷后置紫外光(365nm)下观察。

结果：呈强蓝色荧光。

④2，6-二氯苯酚-靛酚钠

检出物：有机酸与酮酸。

溶液：0.1%本品的乙醇溶液。

方法：喷后微温。

结果：蓝色背景呈红色。

(5)酚类

①Emerson 试剂(4-氨基安替比林／铁氰化钾(Ⅲ))

检出物：酚类、芳香胺类及挥发油。

溶液：I．4-氨基安替比林1g溶于乙醇100ml；

Ⅱ．铁氰化钾(Ⅲ)4g溶于水50ml，用乙醇稀释至100ml。

方法：先喷溶液I，在热空气中干燥5min，再喷溶液Ⅱ，再于热空气中干燥5min，然后将板置含有氨蒸气(25％氨溶液)的密闭容器中。

结果：斑点呈橙-淡红色。挥发油在亮黄色背景下呈红色斑点。

②Boute 反应

检出物：酚类、氯、溴、烷基代酚。

方法：将薄层置有NO2蒸气(含浓硝酸)的容器中3～10min，再用NH2蒸气(浓氨液)处理。 ③氯醌(四氯代对苯醌)

检出物：酚类。

溶液：1％本品的甲苯溶液。

④DDQ(二氯二氰基苯醌)试剂

检出物：酚类。

溶液：2％本品的甲苯溶液。

⑤TCNE (四氰基乙烯)试剂

检出物：酚类、芳香碳氢化物、杂环类、芳香胺类。

溶液：0.5%～1%本品的甲苯溶液。

⑥Gibb’s(2，6-二溴苯醌氯亚胺)试剂

检出物：酚类。

溶液：2%本品的甲醇溶液。

⑦氯化铁

检出物：酚类、羟酰胺酸。

溶液：1%～5%氯化铁的0.5mol／L盐酸溶液。

结果：酚类呈蓝色、羟酰胺酸呈红色。

(6)含氮化合物

①FCNP(硝普钠／铁氰化物)试剂

检出物：脂 肪族含氮化物，如氨基氰、胍、脲与硫脲及其衍生物，肌酸及肌酐。 溶液：10％氢氧化钠溶液、10％硝普钠溶液、10％铁氰化钾溶液与水按1：1：1：3混合，在室温至少放置20min，冰箱保存数周，用前将混合液与丙酮等体积混合。

②Dragendorff(碘化铋钾试剂)试剂

检出物：芳香族含氮化合物，如生物碱类、抗心律不齐药物。

溶液：I．碱式硝酸铋0.85g溶于10ml冰醋酸及40ml水中；

Ⅱ．碘化钾8g溶于水20ml中。 ．

将上述溶液I及Ⅱ等量混合，置棕色瓶中作为储备液，用前取储备液lml、冰醋酸2ml与水l0ml混合。

结果：呈橘红色斑点。

③4-甲基伞形酮

检出物：含氮杂环化合物。

溶液：本品0.02g溶于乙醇35ml，加水至100ml。

方法：喷板后置25％氨水蒸气的容器中,取出后于紫外灯(365nm)下观察。

④碘铂酸钾

检出物：生物碱类及有机含氮化物。

溶液：10％六氯铂酸溶液3ml与水97ml混合，加6％碘化钾溶液，混匀。临用前配制。 ⑤硫酸高铈铵／硫酸

检出物：生物碱及含碘有机化物。

溶液：硫酸铈1g混悬于4ml水中，加三氯乙酸1g，煮沸，逐滴加入浓硫酸直至混浊消失。 方法：喷后薄层于1l0oC加热数分钟。

结果：阿朴吗啡、马钱子碱、秋水仙碱、罂粟碱、毒扁豆碱与有机碘化物均能检出。 ⑥Ehrlich (对二甲氨基苯甲醛／盐酸)试剂

检出物：吲哚衍生物及胺类。

溶液：1％本品的浓盐酸溶液与甲醇按1：1混合。

方法：喷后板于50oC加热20min。

结果：呈不同颜色的斑点。

(7)胺类

①硝酸／乙醇

检出物：脂肪族胺类。

溶液：50滴65％硝酸于乙醇100ml中。

方法：需要时120oC加热。

②2，6-二氯醌氯亚胺

检出物：抗氧剂、酰胺(辣椒素)、伯、仲脂肪胺、仲、叔芳香胺、芳香碳氢化物、药物、苯氧基乙酸除草剂等。

溶液：新鲜制备的0.5％～2％本品乙醇溶液。

方法：喷后薄层于110oC加热10min，再用氨蒸气处理。

③茜素

检出物：胺类。

溶液：O.1％本品的乙醇溶液。

④丁二酮单肟／氯化镍

检出物：胺类。

溶液：I．丁二酮单肟1.2g溶于热水35ml中，加氯化镍0．95g，冷却后加浓氨水2ml； Ⅱ．盐酸羟胺0.12g溶于200ml水中。

方法：将溶液I及Ⅱ混合，放置1天，过滤。

⑤Pauly (对氨基苯磺酸)试剂

检出物：酚类、胺类和能偶合的杂环化合物。

溶液：磺酸4．5g溶于温热的12mol／L盐酸45ml中，用水稀释至500ml，取lOml于冰中冷却，加4．5％亚硝酸钠冷溶液lOml，于OoC放置15min。用前加等体积10％碳酸钠溶液。 ⑥硫氰酸钴(Ⅱ)．

检出物：生物碱、伯、仲、叔胺类。

溶液：硫氰酸铵3g与氯化钴1g溶于水20ml。

结果：白色至粉红色背景上呈蓝色斑点，2h后颜色消退。若将薄层喷水或放入饱和水蒸气容器内，可重现色点。

⑦1，2-萘醌-4-磺酸钠

检出物：芳香胺类。

溶液：本品0.5g溶于95ml水，加乙酸5ml，滤去不溶物即得。

方法：喷后反应30min显色。

⑧葡萄糖／磷酸

检出物：芳香胺类。

溶液：葡萄糖2g溶于85％磷酸l0ml与水40ml混合液中，再加乙醇与正丁醇各30ml。 方法：喷后于115℃加热l0min。

(8)硝基及亚硝基化合物

①α-萘胺

检出物：3，5一二硝基苯甲酸酯、二硝基苯甲酰胺。

溶液：I．O．5％α-萘胺乙醇溶液；

Ⅱ．10％氢氧化钾甲醇溶液。

方法：先喷溶液I，再喷溶液Ⅱ。

结果：呈红褐色斑点。

②二苯胺／氯化钯

检出物：亚硝胺类。

溶液：1.5％二苯胺乙醇溶液与0.1g氯化钯的0.2％氯化钠溶液lOOml，按5：1混合。 方法: 喷后置紫外光(254nm)下观察。

结果：显紫色斑点。

(9)氨基酸及肽类

①茚三酮

检出物：氨基酸、胺与氨基糖类。

溶液：本品O.2g溶于乙醇l00ml中。

方法：喷后于110oC加热。

结果：呈红紫色斑点。

②茚三酮／乙酸镉

检出物：氨基酸及杂环胺类。

溶液：茚三酮1g及乙酸镉2.5g溶于l0ml冰醋酸中，用乙醇稀释至500ml。 方法：喷后于120oC加热20min。

③1，2-萘醌-4-磺酸钠

检出物：氨基酸。

溶液：临用前将本品O.02g溶于5%碳酸钠l00ml中。

方法：喷后室温干燥。

结果：不同氨基酸呈不同色点。

④靛红／乙酸锌

检出物：氨基酸与某些肽类。

溶液：靛红1g与乙酸锌1g溶于95％异丙醇l00ml中，加热至80oC，冷却后加乙酸1ml，冰箱保存。

方法：喷后于80～85"C加热30min。 ．

⑤茚三酮／冰醋酸

检出物：二肽及三肽。

溶液：1％茚三酮吡啶溶液与冰醋酸按5：1混合。

方法：喷后于l00oC加热5min。

⑥香草醛

检出物：氨基酸及胺类。

溶液：I．本品1g溶于丙醇50ml中;

Ⅱ．1mol／L氢氧化钾溶液lml，用乙醇稀释至lOOml。

方法：先喷溶液I后于110oC干燥l0min，再喷溶液Ⅱ，于110oC再干燥l0min，于紫外光(365nm)下观察。

(10)甾类

①香草醛／硫酸

检出物：甾体激素。

溶液：1％香草醛浓硫酸溶液。

方法：喷后于105℃加热5min。

②氯化锰

检出物：雌激素类。

溶液：氯化锰0.2g溶于含硫酸2ml的甲醇60ml中。 方法：喷后置紫外光(365nm)下观察。

③高氯酸

检出物：甾体激素。

溶液：5％高氯酸甲醇溶液。

方法：喷后于110oC加热5min，置紫外光(365nm)下观察。 ④三氯化锑／乙酸

检出物：甾类与二萜类。

溶液：三氯化锑20g溶于乙酸20ml与氯仿60ml混合液中。 方法：喷后于100oC加热5min，紫外光长波下观察。 结果：二萜类斑点呈红黄-蓝紫色。

⑤对甲苯磺酸

检出物：甾族化合物、黄酮类与儿茶酸类。

溶液：20％本品的氯仿溶液。

方法：喷后于100oC加热数分钟，紫外光长波下观察。 结果：斑点呈荧光。

⑥氯磺酸／乙酸

检出物：三萜、甾醇与甾族化合物。

溶液：氯磺酸5ml在冷却下加乙酸l0ml溶解。

方法：喷后于130oC加热5～l0min，置紫外光长波下观察。

结果；斑点显荧光。

(11)糖类

①茴香胺、邻苯二酸试剂

检出物：碳氢化合物。

溶液：1.23g茴香胺及1.66g邻苯二酸于l00ml 95％乙醇中的溶液。

方法：喷雾或浸渍。

结果：己糖呈绿色、甲基戊糖呈黄绿色、戊糖呈紫色、糖醛酸呈棕色。

②四乙酸铅／2，7一二氯荧光素

检出物：甙类、酚类、糖酸类

溶液：I．2％四乙酸铅的冰醋酸溶液；

Ⅱ．1％2，7一二氯荧光素乙醇溶液。

取溶液I、Ⅱ 各5ml混匀，用干燥的苯或甲苯稀释至200ml，试剂溶液只能稳定2h。 方法：浸板。

⑧邻氨基联苯／磷酸

检出物：糖类。

溶液：O.3g邻氨基联苯加85％磷酸5ml与乙醇95ml。

方法：喷板后llOoC加热15～20min。

结果：斑点呈褐色。

④苯胺／二苯胺／磷酸

检出物：还原糖。

溶液：4g二苯胺、4ml苯胺与20ml 85％磷酸共溶于200ml丙酮中。

方法：喷后于85℃加热l0min。

结果：产生各种颜色。1，4-己醛糖、低聚糖呈蓝色。

⑤双甲酮／磷酸

检出物：酮糖。

溶液：双甲酮(5，5-二甲基环己烷-1，3-二酮)10.3g溶于90ml乙醇与l0ml 85％磷酸中。 方法：喷板后于110oC加热15～20min。

结果：日光下观察，白色背景上呈黄色斑点，紫外光长波下呈蓝色荧光。

⑥联苯胺／三氯乙酸

检出物：糖类。

溶液：0.5g联苯胺溶于l0ml乙酸，再加10ml40％三氯乙酸水溶液，用乙醇稀释至l00ml。 方法：喷后置紫外光下照射15min。

结果：斑点呈灰棕-红褐色。

⑦对二甲氨基苯甲醛／乙酰丙酮

检出物：氨基糖类。

溶液：I. 5ml 50％氢氧化钾溶液与20ml乙醇混匀，取此溶液0.5ml，加乙酰丙酮0.5ml与正丁醇50ml的混合液l0ml，此两种溶液均需新鲜配制，临用前混合；

Ⅱ. 1g对二甲氨基苯甲醛溶于30ml乙醇中，再加30ml浓盐酸，需要时此溶液可用正丁醇180ml稀释。

方法：先喷I后于105oC加热5min，再喷Ⅱ，然后于90℃干燥5min。

结果：斑点呈红色。

(12)杀虫剂

①甲基黄

检出物：氯化杀虫剂及抗菌化合物。

溶液：O.1g甲基黄于70ml乙醇中，加25ml水并用乙醇稀释至l00ml。

方法：喷板后于室温干燥，并在无滤光片紫外光下照射5min。

结果：黄色背景上呈红色斑点。

②溴／四氯化碳

检出物：有机磷杀虫剂。

溶液：10％溴的四氯化碳溶液。

方法：薰溴蒸气。

③锰／水杨醛

检出物：有机硫代磷杀虫剂。

溶液：I．100mg氯化锰溶于100ml 80％乙醇；

Ⅱ．溶解1.3g 2-肼喹啉于小量热乙醇中，溶1g水杨醛于5ml乙醇并加1～2滴冰醋酸，合并两溶液并回流30min，冷却后析出水杨-2-醛-2-喹啉腙沉淀，并用乙醇重结晶。用50mg此衍生物溶于100ml乙醇中。

方法：等量溶液I及Ⅱ混合后，喷板。

④二苯胺／氯化锌

检出物：氯化杀虫剂(DDT、CPCA、氯-DDT、克菌丹、甲氧氯、毒杀芬)。

溶液：二苯胺及氯化锌各0.5g溶于100ml丙酮中。

方法：喷后200oC加热5min。

⑤溴／荧光素／硝酸银

检出物：杀虫剂。

溶液；I．5％溴的四氯化碳溶液；

Ⅱ．1ml 0.25％荧光素的二甲基甲酰胺溶液，用乙醇稀释至50ml；

Ⅲ．1.7g硝酸银溶于5ml水中，加2-苯氧基乙醇，用丙酮稀释至200ml。

方法：展开后的薄层置试液I容器中薰30s，取出先喷溶液Ⅱ，再喷溶液Ⅲ，再置紫外光下7min。

(13)黄酮类

①乙醇胺二苯硼酸盐

检出物：黄酮类。

溶液：I. 1％乙醇胺二苯硼酸盐的甲醇溶液；

Ⅱ. 5％聚乙二醇的乙醇溶液。

方法：先喷溶液I，再喷溶液Ⅱ使荧光稳定，再在紫外光长波下照射2min。

结果：紫外灯下观察荧光。

②三氯化锑

检出物：黄酮类。

溶液：10％三氯化锑的氯仿溶液。

方法：喷板。

结果：紫外光长波下呈荧光。

⑧三氯化铝

检出物：黄酮类。

溶液：1％三氯化铝乙醇溶液。

方法：喷板。

结果：紫外光长波下显黄色荧光。

④Benedict(硫酸铜／枸橼酸钠)试剂

检出物：含邻二羟基的黄酮类及香豆精类。

溶液：1.73g 硫酸铜(CuS04?5H20)：17.3g 枸橼酸钠及10g 无水碳酸钠溶于水并稀释至1 00ml。

方法：喷板。

结果：紫外光长波下观察，含邻二羟基的化合物，斑点荧光减弱或猝灭。

(14)含硫化合物

①硝普钠

检出物：巯基-SH基(半胱氨酸)、双硫化物、-s-s-基(胱氨酸)及精氨酸。

溶液：I. 1.5g 硝普钠溶于5ml 2mol／L盐酸溶液及95ml甲醇中，加10ml 25％氢氧化铵溶液，过滤，即得；

Ⅱ. 2g氰化钠溶于5ml水，用甲醇稀释至100ml。

方法：先喷溶液I、再喷溶液Ⅱ。

结果：巯基化合物呈红色；精氨酸由橙变为灰蓝色；双硫化物在黄色背景上显红色。 ②FCNP(硝普钠／铁氰化物)试剂

检出物：脂肪族含硫化台物，如氨基氰、硫脲及其衍生物。

溶液：10％氢氧化钠溶液、10％硝普钠溶液，10％铁氰化钾溶液与水按1：1：1：3混合，用前与等体积丙酮混合，用时新鲜配制。

○3氯化铁／磺基水杨酸

检出物：硫代磷酸酯类。

溶液：I．1％氯化铁的80％乙醇溶液；

Ⅱ．1％磺基水杨酸的80％乙醇溶液，

方法：薄层先置溴蒸气中10min后，喷溶液I，干燥15min，再喷溶液Ⅱ。

结果：紫色背景上呈白色。 、 ：

④叠氮化碘

检出物：含硫氨基酸、硫化物与青霉素。

溶液：叠氮碘溶液-叠氮钠3g 溶乎100ml 0.05mol／L碘溶液中(新鲜配制，固体叠氮碘有爆炸性)。

⑤靛红／硫酸

检出物：噻吩衍生物。

溶液；0.4g靛红溶于100ml浓硫酸中。

方法：喷板后120oC加热。

结果：呈不同颜色。

(15)类脂化合物

①磷钼酸

检出物：胆酸、类脂化物、脂肪酸及甾类。

溶液：250mg 磷钼酸于50ml乙醇中。

方法：唆后予120oC加热。

②罗丹明6G

检出物；类脂化物。

溶液：lg 罗丹明6G溶于100ml丙酮中．

方法：喷后置紫外光长波下观察。

③溴百里酚蓝

检出物：类脂化物。

溶液：O．04g溴百里酚蓝溶于100ml O．01mol／L氢氧化钠溶液中。

(16)阳离子

①双硫腙

检出物：金属离子。

溶液：20mg双硫腙溶于100ml丙酮中，置棕色瓶中于冰箱内保存。 方法：上述溶液喷板后再喷25％氢氧化铵溶液。

②红氨酸 (二硫代草酰胺)

检出物：重金属离子。

溶液：0.5％红氨酸乙醇溶液。

方法：先喷上述溶液，稍干后置薄层于氨蒸气中。。

③茜素

检出物：众多阳离子、稀土及铀。

溶液：茜素乙醇饱和溶液。

方法：喷板后直接放入氨蒸气中。

④亚铁氰化钾

检出物：Fe3+、Cu2+、Cl、Mo、V、W离子。

溶液：新配制的2％亚铁氰化钾溶液。

⑤二苯卡巴肼

检出物：Ag+、pb2+、Hg2+、Cu2+、Sn2+、Mn2+、Zn2+、Ni2+、Co2+及Ca2+离子。 溶液：I．1％～2％二苯卡巴肼乙醇溶液；

Ⅱ．25％氢氧化铵溶液。

方法：先喷溶液I，再喷溶液Ⅱ。

结果：Ni2+呈蓝色、Co2+呈橙褐色、Zn2+呈红紫色，Ag+、pb2+、Cu2+、Sn2+、Mn2+呈褐色、乙酸汞加成物于80oC加热片刻，斑点呈蓝色。

(17)阴离子

①硝酸银

检出物：含硫阴离子、砷酸盐、亚砷酸盐磷酸盐、亚磷酸盐及除氟外的卤素。

溶液：0.1～0.5mol／L硝酸银溶液中加氨水直至沉淀溶解。临用前配制、储存会形成易爆物质。

方法：喷后于110～120oC加热l0min，必要时置紫外光下l0min。

②硝酸银／氢氧化铵／荧光素

检出物：卤素离子。

溶液：I．1g硝酸银溶于l00ml O.5mol／L氢氧化铵溶液中；

Ⅱ．1g荧光索溶于l00ml乙醇中。

方法：先喷溶液I，稍干，再喷溶液Ⅱ。

③钼酸铵／亚硫酸钠

检出物：硫化物、硫代硫酸盐与磷酸盐。 ：

溶液：I．5％钼酸铵的lmol／L硫酸溶液；

Ⅱ．5％亚硫酸钠溶液。

方法：先喷溶液I，再喷溶液Ⅱ，于105℃加热30min。

结果：硫化物及硫代硫酸盐呈深蓝色，磷酸盐呈蓝灰色。

④番木鳖碱

检出物：溴酸盐、硝酸盐、氯酸盐。

溶液：I．0.02％番木鳖碱的lmol／L硫酸溶液；

Ⅱ．2mol／L氢氧化钠溶液。

方法：先喷溶液I，再喷溶液Ⅱ。

结果：溴酸盐、氯酸盐呈血红色，硝酸盐呈橙黄色。

（四）.其他常用与专用显色剂：

碘：

适用于不饱和或者芳香族化合物

配制方法：在100ml 广口瓶中，放入一张滤纸，少许碘粒。

或者在瓶中，加入10g 碘粒，30g 硅胶

高锰酸钾

适用于含还原性基团化合物，比如羟基，氨基，醛

配制方法：1.5g KMnO4 + 10g K2CO3 + 1.25mL 10% NaOH +200mL 水. 使用期3 个月

磷钼酸(PMA)

广谱

配制方法：10 g of 磷钼酸+100 mL 乙醇

紫外灯

适用于含共轭基团的化合物，芳香化合物

硫酸铈：

生物碱

配制方法：10%硫酸铈(IV)+15%硫酸的水溶液氯化铁

苯酚类化合物

配制方法：1% FeCl3 + 50% 乙醇水溶液.

桑色素(羟基黄酮)

广谱, 有荧光活性

配制方法：0.1% 桑色素+甲醇

茚三酮

适用于氨基酸

配制方法：1.5g 茚三酮+ 100mL of 正丁醇+ 3.0mL 醋酸

二硝基苯肼(DNP)

适用于醛和酮

配制方法：12g 二硝基苯肼+ 60mL 浓硫酸+ 80mL 水+ 200mL乙醇 香草醛(香兰素)

广谱

配制方法：15g 香草醛+ 250mL 乙醇+2.5mL 浓硫酸

溴甲酚绿

适用于羧酸，pKa<=5.0

配制方法：在100ml 乙醇中，加入0.04g 溴甲酚绿，缓慢滴加0.1M的NaOH 水溶液，刚好出现蓝色即至。

钼酸铈

广谱

配制方法：235 mL 水+ 12 g 钼酸氨+ 0.5 g 钼酸铈氨+ 15 mL浓硫酸

茴香醛(对甲氧基苯甲醛)1

广谱

配制方法：135 乙醇+ 5 mL 浓硫酸+ 1.5 mL of 冰醋酸+ 3.7 mL茴香醛，剧烈搅拌，使混合均匀.

茴香醛(对甲氧基苯甲醛)2

适用于萜烯，桉树脑(cineoles), withanolides, 出油柑碱(acronycine)

配制方法：茴香醛:HClO4:丙酮:水(1:10:20:80)经常需要利用溶剂的极性大小，对展开剂的极性予以调整。

四、薄层层析法具体操作注意事项

（一）铺板

铺板用的匀浆不宜过稠或过稀：过稠，板容易出现拖动或停顿造成的层纹；过稀，水蒸发后，板表面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶G:水=1：2～3，硅胶G:羧甲基纤维素钠水溶液=1:2。研磨匀浆的时间，根据经验来定，与空气湿度有关，一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断，越稠越难下滴。匀浆的稀稠除影响板的平滑外，也影响板涂层的厚度，进一步影响上样量。涂层薄，点样易过载；涂层厚，显色不那么明显。通常，板的质量对薄层鉴别的影响不是很大，影响最大的是展开剂的配制和展开系统的饱和。

二）点样

尽量用小的点样管。如果有足够的耐性，最好只用1微升的点样管。这样，点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。样品溶液的含水量越小越好，样品溶液含水量大，点样斑点扩散大。样品溶液的溶剂一般是无水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。点好样的薄层板用电吹风的热风吹干或放入干燥器里晾干。

（三）展开剂配制

选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗，强烈振摇使混合液充分混匀，放置，如果分层，

取用体积大的一层作为展开剂。绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸，振摇展开缸来配制展开剂。混合不均匀和没有分液的展开剂，会造成层析的完全失败。各组成溶剂的比例准确度对不同的分析任务有不同的要求，尽量达到实验室仪器的最高精确度，比如：取1ml的溶剂，应使用1ml的单标移液管，移液管应符合计量认证要求，尽管多数时候这不是必须的。

（四）展开系统的饱和

一般使用的是双槽的展开缸，一槽用来放展开剂，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展开的板放入两槽间的平台，斜架着，盖上展开缸的盖子。让展开剂的蒸气充满展开缸，并使薄层板吸附蒸气达到饱和，防止边沿效应，饱和时间在半个小时左右。展开时难免要打开盖子把薄层板放入展开剂中，不过对薄层板与蒸气的吸附平衡影响不大，当然动作应该尽量轻、快。 温湿度的控制温湿度对薄层影响都很大。不冻结的前提下，通常温度越低分离越好，较难的分离需在低温下分离，例如人参皂苷。湿度的影响，估计主要是影响薄层板的吸附能力，导致选择性（容量因子）的变化，湿度应根据实际情况确定。温度控制使用空调器或冰柜，湿度控制是通过在另一展开槽放置相应浓度的硫酸。

（五）显色：

喷显色剂显色最重要是有好的雾化器

五、TLC切记的要点

（一）、某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开，极性太大，也分不开.一般以目标产物的Rf值在0.3左右为最佳。

（二）、点不能点得太浓,否则容易重叠,不易判断,因为如果两个点相近的话,一浓就变成一个点了。

（三）、板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关，只有两者比较合适了，才能有一个交好的分离效果。

选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷<己烷<苯<乙醚<THF<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇&NBSP; 使用单一溶剂，往往不能达到

很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的作用，

常用的溶剂组合有：

Petroleum ether/Ethyl acetate, Petroleum ether/Acetone, Petroleum ether/Ether, Petroleum ether/CH2Cl2, CH2Cl2/ethyl acetate, ethyl acetate/ MeOH, CHCl3/ethyl acetate

展开剂的比例要靠尝试.一般根据文献中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果。我在实验中，为了实现一个配体与其他杂质有效分离，曾经尝试了所有的溶剂用来两两组合后，最后才找到petroleum ether/THF这类不常见的混合溶剂。

一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例,达到最佳效果，如果没有分开的迹象，最好是换溶剂。

对于在硅胶中这种酸性物质上易分解的物质，在展开剂里往往加一点点三乙胺，氨水，吡啶等碱性物质来中和硅胶的酸性。当然，选择所添加的碱性物质，还必须考虑容易从产品中除去，氨水无疑是较好的选择。

这里要特别强调的一点是：分离效果的好坏和所用硅胶和溶剂的质量很有关系。 不同厂家生产的硅胶可能含水量以及颗粒的粗细程度，酸性强弱不同，

从而导致产品在某个厂家的硅胶中分离效果很好，但在另一个厂家的就不行。

溶剂的含水量和杂质含量对分离效果都有明显的影响。温度对分离效果影响也很明显。我们实验室没有空调，我在实验过程发现，在夏天分离相同的产品，所需的淋洗剂极性要比在冬天小很多，这一点大家也是可以理解的。 鉴于此，使用的硅胶，不用时一定要密封，防止吸潮。TLC所用的硅胶板一定要保存在干燥器里面，或使用前在红外烘箱里干燥一段时间。 在利用TLC跟踪反应时，在点板的时候往往是反应体系的混和溶液点一个点A，每种

难挥发的原料各点一个点B,C, D等等，然后所有的原料和反应体系的混合溶剂再共同点一个混合点X，这些点在板上的位置如图所示：

这样的好处是展开后可以清楚地看见每个点的位置，把A这个点展开后的各个层份的点与B,C,等原料比较，从而判断原料消失没有，点混合点X的目的在于，方便观察，因为有时候，板展开后，各点的位置有些变形，或者由于边缘效应等等，使得判断不易。

利用TLC判断物质的纯度时，往往要和NMR相结合，因为某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。但有趣的是，由于H1NMR可鉴别的纯度也就在95%左右，有时候H1NMR现示较纯的东西，一点板就会发现有几个点。所以，两者要结合使用。但是自己以前的样品，则可以只通过点板来判断纯度。

（四）纠正以下几个错误：

1、 “由于层析柱和薄板的不同，即使两者使用的硅胶都相同，但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释一倍”，如果使用手工铺的TLC摸条件，则不必将洗脱剂的洗脱强度减小一倍，这种说法仅适用于使用预制高效板（HPTLC）的情况。

2、 “对于在硅胶中这种酸性物质上易分解的物质，在展开剂里往往加一点点三乙胺，氨水，吡啶等碱性物质来中和硅胶的酸性。当然，选择所添加的碱性物质，还必须考虑容易从产品中除去，氨水无疑是较好的选择”，这应区分是柱层还是TLC，对于柱层添加二乙胺比较好，对于分析TLC添加三乙胺或用氨水薰（不是加到展开剂里）都可以。

展开剂得选择

做有机合成时走板子是常有的事，展开剂的选择就至关重要了。

选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷<

己烷<苯<乙醚<THF<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的作用，展开剂的比例要靠尝试.一般根据文献中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。展开剂的选择条件：①对的所需成分有良好的溶解性；②可使成分间分开；③待测组分的Rf在0.2~0.8之间，定量测定在0.3～0.5之间；④不与待测组分或吸附剂发生化学反应；⑤沸点适中，黏度较小；⑥展开后组分斑点圆且集中；⑦混合溶剂最好用新鲜配制。 一般来说，弱极性溶剂体系的基本两相由正己烷和水组成，再根据需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯来调节溶剂系统的极性，以达到好的分离效果，适合于生物碱、黄酮、萜类等的分离；中等极性的溶剂体系由氯仿和水基本两相组成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于蒽醌、香豆素，以及一些极性较大的木脂素和萜类的分离；强极性溶剂，由正丁醇和水组成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于极性很大的生物碱类化合物的分离。很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果。我们在实验中，为了实现一个配体与其他杂质有效分离，曾经尝试了很多种的溶剂组合，最后才找到石油醚

—EtOAc—HCOOH（5.5：3.5：0.1）混合溶剂。一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例（或者加入第三种溶剂）,达到最佳效果；如果没有分开的迹象（斑点较“拖”），最好是换溶剂。对于在硅胶中这种酸性物质上易分解的物质，在展开剂里往往加一点点三乙胺，氨水，吡啶等碱性物质来中和硅胶的酸性。（选择所添加的碱性物质，还必须考虑容易从产品中除去，氨水无疑是较好的选择。）分离效果的好坏和所用硅胶和溶剂的质量很有关系：不同厂家生产的硅胶可能含水量以及颗粒的粗细程度，酸性强弱不同，从而导致产品在某个厂家的硅胶中分离效果很好，但在另一个厂家的就不行。溶剂的含水量和杂质含量对分离效果都有明显的影响。温度，湿度对分离效果影响也很明显，在实验中我们发现有时同一展开条件，上下午的Rf截然不同 。

 展开剂的选择主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素来考虑，在进行薄层层析时，首先应该知道未知化学成分的类型，其极性的大致归属，从提取液或从色谱柱的流动相极性可知，另外某样品里含多种化学成分先按极性不同大致分，然后细分，对于分离未知的化学物质，展开剂的选择也是一个摸索的过程，不应该仅仅从展开剂考虑，多因素综合

衡量！溶剂：层析过程中溶剂的选择，对组分分离关系极大。在柱层析时所用的溶剂（单一剂或混合溶剂）习惯上称洗脱剂，用于薄层或纸层析时常称展开剂。洗脱剂的选择，须根据被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑在用极性吸附剂进行层析时，当被分离物质为弱极性物质，一般选用弱极性溶剂为洗脱剂；被分离物质为强极性成分，则须选用极性溶剂为洗脱剂。如果对某一极性物质用吸附性较弱的吸附剂（如以硅藻土或滑石粉代替硅胶），则洗脱剂的极性亦须相应降低。在柱层操作时，被分离样品在加样时可采用于法，亦可选一适宜的溶剂将样品溶解后加入。溶解样品的溶剂应选择极性较小的，以便被分离的成分可以被吸附。然后渐增大溶剂的极性。这种极性的增大是一个十分缓慢的过程，称为“梯度洗脱”，使吸附在层析柱上的各个成分逐个被洗脱。如果极性增大过诀（梯度太大），就不能获得满意的分离。溶剂的洗脱能力，有时可以用溶剂的介电常数（ε）来表示。介电常数高，洗脱能力就大。以上的洗脱顺序仅适用于极性吸附剂，如硅胶、氧化铝。对非极性吸附剂，如活性炭，则正好与上述顺序相反，在水或亲水住溶剂中所形成的吸附作用，较在脂溶性溶剂中为强。

被分离物质的性质

被分离的物质与吸附剂，洗脱剂共同构成吸附层析中的三个要素，彼此紧密相连。在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下，各个成分的分离情况，直接与被分离物质的结构与性质有关。对极性吸附剂而言，成分的极性大，吸附住强。当然，中草药成分的整体分子观是重要的，例如极性基团的数目愈多，被吸附的住能就会更大些，在同系物中碳原子数目少些，被吸附也会强些。总之，只要两个成分在结构上存在差别，就有可能分离，关键在于条件的选择。要根据被分离物质的性质，吸附剂的吸附强度，与溶剂的性质这三者的相互关系来考虑。首先要考虑被分离物质的极性。如被分离物质极性很小为不含氧的萜烯，或虽含氧但非极性基团，则需选用吸附性较强的吸附剂，并用弱极性溶剂如石油醚或苯进行洗脱。但多数中药成分的极性较大，则需要选择吸附性能较弱的吸附剂（一般Ⅲ～Ⅳ级）。采用的洗脱剂极性应由小到大按某一梯度递增，或可应用薄层层析以判断被分离物在某种溶剂系统中的分离情况。此外，能否获得满意的分离，还与选择的溶剂梯度有很大关系。现以实例说明吸附层析中吸附剂、洗脱剂与样品极性之间的关系。如有多组分的混合物，象植物油脂系由烷烃、烯烃、舀醇酯类、甘油三酸醋和脂肪酸等组份。如对于C-27甾体皂甙元类成分，能因其分字中羟基

数目的多少而获得分离：将混合皂甙元溶于含有5％氯仿的苯中，加于氧化铝的吸附柱上，采用以下的溶剂进行梯度洗脱。如改用吸附性较弱的硅酸镁以替代氧化铝，由于硅酸镁的吸附性较弱，洗脱剂的极牲需相应降低，亦即采用苯或含5％氯仿的苯，即可将一元羟基皂甙元从吸附剂上洗脱下来。这一例子说明，同样的中草药成分在不同的吸附剂中层析时，需用不同的溶剂才能达到相同的分离效果，从而说明吸附剂、溶剂和欲分离成分三者的相互关系。

（二）簿层层析：薄层层析是一种简便、快速、微量的层析方法。一般将柱层析用的吸附剂撒布到平面如玻璃片上，形成一薄层进行层析时一即称薄层层析。其原理与柱层析基本相似。

1．薄层层析的特点：薄层层析在应用与操作方面的特点与柱层析的比较。

2．吸附剂的选择：薄层层析用的吸附剂与其选择原则和柱层析相同。主要区别在于薄层层析要求吸附剂（支持剂）的粒度更细，一般应小于250目，并要求粒度均匀。用于薄层层析的吸附剂或预制薄层一般活度不宜过高，以Ⅱ～Ⅲ级为宜。而展开距离则随薄层的粒度粗细而定，薄层粒度越细，展开距离相应缩短，一般不超过10厘米，否则可引起色谱扩散影响分离效果。

3．展开剂的选择：薄层层析，当吸附剂活度为一定值时（如Ⅱ或Ⅲ级），对多组分的样品能否获得满意的分离，决定于展开剂的选择。中草药化学成分在脂溶性成分中，大致可按其极性不同而分为无极性、弱极性、中极性与强极性。但在实际工作中，经常需要利用溶剂的极性大小，对展开剂的极性予以调整。

薄层色谱小知识

1、怎样提高点样效率？ 点样是造成TLC定量误差的主要来源。

实验证明：定量毛细管更适合较小体积的点样；微量注射器更适合较大体积的点样。这主要是因为微量注射器受小气泡、溶液回爬现象的影响较大。为避免不同定量毛细管理体制的占样误差，建议一块薄层板上最好用同一只定量毛细管。但应注意更换样品时，应将毛细管用超声波或不同极性溶课剂清洗干净。在制备样品时，溶样溶剂黏度不能过高，以便于点样；溶剂沸点过低则进样体积易变，过高则会改变展开剂组成；对样品溶解度过高会使样点发生空心现象，常用的溶剂为甲醇、乙醇、丙酮。经典TLC样点原点一般为直径3mm点间距离

1-2cm底边距离1.5cm;HPLC样点原点一般为直径1mm点间距5mm底边距1cm.

2、展开剂的选择

TLC与HPLC相比，一个突出的优点就是流动相的选择具有更大的灵活性，流动相的选择的目的是使绝大部分样品的Rf值位于0.1－0.7之间并达到较好的分离，与此对应的是流动相要有适当的强度和组成。流动相强度越大，溶质Rf值越大，但很可能降低分离能力；另外单一溶剂很难分离较复杂的混合物、根据相似相溶原理，要使用多元溶剂体系。一般展开剂体系选择如下：根据分离样品性质、薄层色谱板性质选择一个二元溶剂体系，通过调节溶剂比例以寻求适合Rf值，适合的Rf值找到后，再寻求极性参数相同的二元溶剂体系两个，以这三个组成为三点组成一个三角形，则可看到：三角形顶点是二元体系，边是三元体系，三角形内是四元体系，并且极性一致，可根据几何原理得出任一点组成，这种方法较为直观，也较简单。

3、TLC的通用显色方法

理想的显色希望灵敏度高，斑点颜色稳定、斑点与背景间的对比度好，斑点的大小及颜色的深度与物质的量成正比，在样品组成并不完全已知的情况下，通用显色方法显得尤为重要，通用显色方法主要有：

1、紫外照射法：方便、不破坏样品；

2、碘蒸气法：通用性强，与紫外法结合灵敏度高于该两法单独使用；

3、荧光试剂：制造荧光背景，使原来紫外下无荧光物质被鉴别，有荧光物质更明显；

4、硫酸溶剂：对绝大多数有机物有效，但有破坏性。

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