小型薄层色谱在药物合成中的使用方法经验总结

   薄层色谱法(TLC,thin-layer chromatography)是一种在铺成薄层的固体上进行的平面色谱方法, 由俄国学者N·A·Izmailov等在1938年首次报导。但直到1956 年德国学者E1Stahl较完整地发展了这个方法,TLC才得到广泛重视和研究,成为色谱法的一个重要分支,处于活跃和发展状态。EStahl因此项工作获得IUPAC的Talanta(分析化学)大奖。薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)具有相同的分离原理,是依据不同物质在流动相与固定相之间的吸附和解吸速率不同来进行物质的分离。薄层色谱与纸色谱、柱色谱等属于传统分析;高效液相色谱、质谱、气谱等属于仪器分析。随着时代的发展,仪器分析渐渐取代传统分析,现已成为主流。仪器分析在精密性、准确性、连续性、重现性等方面,有着传统分析达不到的优点。例如定量分析多组分有机混合物,或者在有标准品的情况下确定未知物时, HPLC法与TLC法比较,具有准确度高、重现性强的优点。但是和传统分析比较,仪器分析主要的弱点就是不灵活,必须按照固定的程序操作,更改条件比传统方法繁琐得多。其次是成本高的问题,先期投入大、人员培训周期长、运行维护的人力、物力费用高。相反,这些正是传统分析的优点。因此,在普通的有机合成、精细化工实验室,传统分析仍不可完全被代替,其优势在于灵活多变、应用方便、成本低廉。TLC法有着悠久的历史,随着经济发展,对外交流增多,很多实验室已采用商品化的薄层板,如涤纶片基硅胶板。商品化硅胶板和自制硅胶板相比,具有性能稳定、重现性高的特点,可进行半定量分析^[1]。

    总之，与经典的柱上色谱,常用的气相色谱、纸上色谱,以及较近发展起来的高效液相色谱比较,TLC有以下特点:1) 设备简单,操作方便;2)快捷,展开时间短;3)可采用多种固定相及显色手段,方法多样而高效;4)可广泛选择流动相;5)检出灵敏度高,一般可达10^-10g以下;6)样品量适用范围大；7)技术多样化, 特别是二维展开、浓度梯度展开等,展开机理亦有吸附、分配、离子交换、电泳、等电聚焦等多种,可联合采用数种手段,为其它色谱技术所不及。以上是TLC的长处,但应当指出,TLC在自动化程度及分离效果上比气相色谱和高效液相色谱稍差,分析特别复杂的样品有时有困难,也不适于挥发性样品的分析。近年来,发展了高压TLC、高效离心TLC、圆柱TLC、等离子检出等新技术,TLC在自动化和高效方面已达到与高效液相色谱同等的水平。小型薄层色谱(m-TLC)技术作为合成实验中的常规监测手段以及TLC和其它色谱技术的前导技术发挥着重要作用。m-TLC技术细节的掌握和未知体系技术参数的确定是m-TLC应用于新的反应体系的关键^[2]。

1 薄层色谱的制作

1.1 使用的化学药品和仪器有:

(1)化学药品: 使用的主要化学药品列于表1。

 

(2)仪器:m-TLC仪器一套,自备包括m-TLC基板,展开槽,显色槽。                                    

1.2 m-TLC薄层板的制备

(1)将(2.5×7.5)cm²载玻片依次用水和乙醇洗净，晾干。要求玻片无划痕, 水膜均匀,完全洁净。置玻片于80℃烘箱干燥,转入干燥器冷却至室温,备用。

(2)用110g硅胶-G配2.5mLCMC-Na水溶液(0.50%,w/w)调制硅胶糊(slurry)。

(3)将硅胶糊均匀涂于(2.5×7.5)cm²载玻片上,每块载玻片约用0.2～0.4g硅胶(干重)。保持薄板水平,令其自然干燥1～2d。其间保持薄板洁净。

(4)将薄板放入110℃烘箱活化30min。

(5)将薄板转入干燥器,令其自然冷却至室温,备用。

2 薄层板制备的常见问题及解决方法

2.1关于配制CMC-Na：

CMC-Na是一种高分子材料,而高分子材料的溶解必然都会有一个溶胀、溶解的过程,所以配制的时候,应该将称好的CMC-Na逐量的撒在水的表面,让其自然沉降,注意要散开平铺,这样能够充分浸润,使其溶胀,之后可以置于水浴锅内加热溶解,当然如果你不是很急着用的话也完全可以直接用水泡着放一边,泡个几天也是可以用的。以下是配置CMC-Na过程中需要注意的方面：

(1) 先将称好的CMC-Na加入所需水量的8/10,让其充分溶涨后,再加热煮沸,然后将剩余水慢慢加入。这样在煮沸过程中不易形成颗粒,煮沸时间短.0.5%CMC-Na与水如果不好溶涨，可在溶涨前加几滴乙醇，比较好溶，但是尽量不加，因为加入乙醇后使CMC-Na的粘合性降低。CMC-Na溶液煮了以后不能再用冷水兑，否则，几天以后就会变绿，起霉。而且放置时间太长的CMC-Na溶液可能会发黄，如果有霉菌出现，绝对不能再使用。
(2)CMC-Na溶液的浓度0.3%-0.7%比较合适，实际操作中0.4％～0.5％最为实用，浓度高了，将来显色时,如果有加热过程稍不小心板子容易发黑;浓度低了铺出来的板子不结实，轻轻一碰就掉渣，不好保存，而且点样时如果紧张，容易出洞。

(3)在CMC-Na的溶解过程中，可以使用有加热操作功能的磁力搅拌器，大概搅拌5小时，应该可得到满意的效果。而且这样就可以使CMC-Na溶解，并且溶液更澄清。如果有抽滤装置你可以直接把CMC-Na溶液滤过，就可以不必等它沉淀再取上清液了，这样做还有两个好处：一是节省CMC-Na溶液，二是倒滤过的CMC-Na溶液的时候不必担心会把下层的不溶物倒出来。过滤CMC-Na溶液的办法，在布氏漏斗上平铺薄薄一层脱脂棉（保证每个小孔都没漏掉），用蒸馏水润湿脱脂棉，启动真空泵，抽紧后就可以倒CMC-Na溶液了，要保证滤过的溶液澄清透明，而且长时间放置不沉淀。关于CMC-Na的后处理，过滤，或者抽滤都可以，有的实验者觉得可能速度很慢，而且又容易浪费。所以采用的做法是离心，5000rpm离心20min。倒出上清液，上清液非常清，也同时消除了过滤过程中可能发生的污染。下面没有充分溶解的CMC-Na。继续加到水中，还可以继续配制使用。另外还有一种处理方法：先将CMC-Na溶解完全,可将其溶解成所需浓度，加热后超声处理,再抽滤,可很快得到上清液。

2.2 关于薄层板的要求：

(1)载板要求平滑清洁，没有划痕，在使用前可用洗涤液或肥皂水洗涤，再用水冲洗干净。

判断载板是否洗干净的标准：拿在手上立起来，如果发现水不是呈股流下，而是呈瀑布状态流下，说明玻璃已经洗干净。（真正洗干净的玻璃，很快就可以晾干。）

(2)清洗用过后的薄层板，可用洗衣粉、洗洁净，反复洗数遍，如果仍然挂水珠，可用洗液泡。如果还解决不了那就只好放弃这块玻璃板了。

2.3 关于研磨及铺板要求：

     取薄层层析硅胶重量与CMC-Na的体积比为1：4的比例（该比例能使硅胶板铺出的效果较好不至于掉渣也不至于板太硬）充分混合碾磨，至拿起碾锤能看到混合液与碾锤有一定的粘连。即好。

(1)硅胶的研磨，必须是一个方向，可以适量的加入一定量的无水乙醇（10g吸附剂加入3滴95％乙醇）或丙酮来消泡，也可以适当搅拌后放在干净容器内超声。

(2)依据薄层板使用需要，将适量研好的吸附剂倒在薄层板上，先用小锤将吸附剂荡匀，倾斜层析板，使吸附剂流至层析板一侧，待吸附剂蓄积一定量后，再反向倾斜层析板，使吸附剂回流；然后是另外两个方向，重复上述操作，后轻颠几下薄层板即可。

(3)铺板时，给载板倒吸附剂时要注意不要引入小气泡。如有需要，可以双手10个指头托住玻璃板，有节奏的颠簸，使得糊状硅胶分布匀称。尤其是载板的四个角，容易高出玻璃板其他部位，所以要格外注意。颠好的板，表面看上去要光滑平整，没有气孔。薄层板铺好后一定要放置在平的台面上，否则难保证板面硅胶的厚度均匀。

(4)铺制好的薄层板先让其稍干后,即看不出有明显的水印,放入烘箱内用50度以下的温度并开鼓风干燥30分钟,再升温干燥至干,注意升温过快在使用的过程中有可能发生起层的现象不利于分离。

2.4 关于展开剂：

(1)分离的样品酸性比较大，一般在展开剂中加酸。

(2)加甲酸是因为该样品是酸性的，加酸的量和该物质的酸性成正比关系，加水可能是因为样品是苷类的用酸水做一下缓冲，目的就是让斑点圆滑，不脱尾，展距良好。

(3)饱和也非常重要，边缘效应很严重的，可将下端浸在展开剂中的滤纸贴在展开缸的内壁，这样可增强饱和效果。

(4)在层析缸口涂适量凡士林，增加密封性；
(5)根据展开剂边缘效应的大小，确定展开剂平衡时间的长短，一般平衡时间在30分钟即可。

(6)有机溶剂的极性，甲醇>氯仿，因此在氯仿：甲醇：氨水 （10:1:0.6）这个展开剂中，如极性略大，可适当降低甲醇比例；如极性太小，可适当增大甲醇比例。
另外还有一个问题，这个展开剂中，甲醇用量较小，而甲醇又易挥发，容易产生边缘效应，要特别注意展开剂的平衡和层析缸的密封。

2.5 关于展开：

    TLC中样品拖尾现象及跑成几乎为一条线,斑点没有清晰的分离的原因及解决方法。

造成这两个问题的原因基本相同：
(1)对于一些具有酸碱性的化学成分，在溶液中部分电离，事实上展开时存在分子、离子两种状态，以中性的有机试剂展开必然会出现两种层析行为，造成脱尾甚至是一条线；
(2)展开剂选择不当；
(3)点样量过大，样品超载。

(4)点样后，用吹风机吹，使样点固化，进而有部分样品强烈地吸附在吸附剂的颗粒上，导致拖尾。

解决办法：
(1)在展开剂中加几滴甲酸或冰醋酸；
(2)展开时以氨水饱和；
(3)在铺板时用稀酸溶液（如0.1～0.2mol/L的草酸溶液）代替水制成酸性薄层，在铺板时用稀碱溶液（如0.1～0.2mol/LNaOH溶液）代替水制成碱性薄层。还可以制成缓冲溶液代替水以制成一定PH值的薄层；
(4)减少点样量；

(5)参考文献，调整展开剂种类、比例；

(6)尽量不要用吹风机吹热风或吹时不要靠的太近。

2.6 关于显色：

  2.61 通用的显色方法

    分离的化合物若有颜色，很容易识别出来各个样点。但多数情况下化合物没有颜色，要识别样点，必须使样点显色。通用的显色方法有显色剂显色（碘蒸气显色）、紫外线显色和荧光薄层板显色:
(1)碘蒸气显色：将展开的薄层板挥发干展开剂后，放在盛有碘晶体的封闭容器中，升华产生的碘蒸气能与有机物分子形成有色的缔合物，完成显色。
(2)紫外线显色：用掺有荧光剂的固定相材料（如硅胶F，氧化铝F等）制板，展开后在用紫外线照射展开的干燥薄层板，板上的有机物会吸收紫外线，在板上出现相应的色点，可以被观察到。

(3)荧光薄层板检测：荧光薄层是在硅胶中掺入少量荧光物质制成的板，在254nm紫外灯，整个薄层板显黄绿色荧光，被测物质由余吸收了部分照射在此斑点位置的紫外线，而呈现各种颜色。

(4)在显色剂显色中，用高锰酸钾-硫酸液显色时，配制方法为把500mg高锰酸钾溶在15ml浓硫酸中。注意要少量地慢慢混合，因为锰的七氧化物有爆炸性。结果为在粉底本色上产生白色斑点。

  2.62 实验中常见问题

(1)在工作中研究过用硫酸乙醇显色作定量分析的品种，但凡加了CMC的板都易烘糊，尤其是温度高于100度时，后改用不加CMC铺的水板来作，就不会有烘糊现象，故也可推论CMC易于与硫酸起糊化反应。

(2)虽然改用不加CMC铺的水板来作不会有烘糊现象，但不加CMC铺的板又太软，点样时容易点出洞，办法是：一、将CMC的浓度调至0.1%，这样就不易烘黑的；二、当喷完显色剂后不要在放烘箱里烘，可以用电吹风在板子背面吹吹就能显色了．此法简便、快洁．如果非想使用烘箱烘的话，一定要用带玻璃窗的，当看到显色了就取出，不然不好控制显色时间，时间过长，CMC容易碳化变黑.另还要注意显色剂，如果显色剂中含有硫酸，加热时间一定要掌握好，不可太长。一般实验室常用带有石棉网的电炉加热。

(3)这里要区别板烘糊和样品烘糊两个概念，样品烘糊是也是一种显色方法。如糖类加热后会碳化，便于观察。这时对板的要求较高，一般为水板^[4]。

2.7 关于裂板：

(1)板子会裂口，一则可能是因为硅胶的比例太大，二则可能是板在常温下没有完全晾干，从表面看是干了，但是最中间的没有干，所以在烘箱中活化导致裂口。如果铺完不久就在较高温度下，特别是直接放入105度的烘箱烘，裂板的几率就会更高。

(2)正确的方法是先用低温大约40度左右烘30分钟左右，或在常温下凉几天，然后再用105度活化。

3 薄层色谱应用

(1)用于判断两个化合物是否相同（同一展开条件下是否有相同的移动值）；
(2)用于确定混合物中含有的组分数；
(3)用于为柱色谱选择合适的展开剂，监视柱色谱分离状况和效果；
(4)用于检测反应过程；

(5)商品化薄层板可用于半定量分析；

(6)确定适宜反应温度和时间。

4 值得进一步探讨的问题

4.1黏结剂

   粘合剂分为无机粘合剂和有机粘合剂：

   无机黏结剂——石膏（硫酸钙），无机黏结剂的优点是：耐高温，耐酸碱，但涂铺薄板动作要快，否则匀浆易凝固。薄层强度差。

   有机黏结剂——羧甲基纤维素钠（CMC）、淀粉、聚乙烯醇、高分子聚合物等。其特点是薄层强度高、使用方便，但不能用浓硫酸作显色剂。

   因此希望能找到一种粘合剂，在配置时具有有机和无机粘合剂的优点，同时匀浆不易凝固，且能用浓硫酸显色。

4.2 TLC在实际应用中也受到很多条件制约,下面根据实际应用薄层色谱的经验来做出具体说明。

(1)薄层色谱适用于挥发性较小、在空气中比较稳定的物质,象苯胺、甲苯等易挥发物质和重氮盐等易分解物质不适用此法分析,但此类物质并不影响薄层色谱的应用;有时对重氮盐也可进行定性分析,要看实际应用中所需要达到的目的。另外如果原料和产物均为无色且在紫外光照射下也无吸收的物质,如十二烷基磺酸钠、丙三醇等非芳香族物质也不适合用此法分析。

(2)能够用薄层进行分离的物质应满足一定的条件。两个物质Rf值之差应不小于0.1;例如在燃料合成中：染料分子量大部分在600到1200之间,属于大分子,但不属于高分子;中间体分子量一般都在90～400之间,前后产物一般在Rf值方面都会有较明显的变化(分子量仅是Rf值的影响之一)，而且因为染料是有色物质,很多情况下,即使Rf值相同也可根据颜色判断反应的程度 ,这是用薄层色谱检测染料合成的最大优点。染料合成属于有机反应,每步反应通常在1小时～5小时,不同品种的不同步骤差别很悬殊。而用TLC法检测染料合成终点通常在20分钟～30分钟之间,个别情况下时间更短,不会影响工作进度。因此利用薄层色谱法研究反应情况是可行的。

(3)一般文献介绍薄层色谱的应用时,点样使用毛细管,但在实际操作中发现,这对操作水平要求比较高,动作慢或操作不当对分析时间有影响。这是因为,为了在板层上点出大小均匀的斑点,每次吸取的量应当保持大致相同,这要求用毛细管吸收的溶液在管中保持相同的高度,前提是毛细管粗细必须相同,如果不同,更难达到要求。如果让毛细管达到饱和吸收状态,即底端接触液面,直至溶液在毛细管中停止上升为止,再取出毛细管。这样虽然每次取的量可以定量,但在板层上会留下较大的斑点,对板层展开距离的要求就要提高,否则不能对两个似分未分的斑点做出准确的判断。若是不将毛细管中所有溶液都点在板层上,就又存在了管中液面下降高度差的问题,这比吸收溶液的操作更难把握。因为在点样的瞬间,既要使溶液点到板上,又不能把板层上的硅胶扎破,是一项难度较大的操作,扎破硅胶容易导致展开的斑点拖尾而影响判断。因此,极易因点出一个大斑点而使刚点的其他符合要求的斑点变得失去意义,有时在点到最后一个斑点时,常常因为紧张而前功尽弃。如何解决这个问题还要经过实践来检验。通过试验,在点样过程中弃用传统的毛细管点样法,改用直径在112mm～118mm的细玻璃棒来点样,基本可以解决上述问题。现简述如下:普通的玻璃加工操作即可获得所需的细玻璃棒;取样量易控制,只需垂直接触液面,再即刻取出就可以点样;操作熟练以后,还可倾斜接触液面,对取样量进行控制。点样时,将玻璃棒顶端呈半球状的液面接触板层表面即可,玻璃棒本身不必触及板层表面;用过的玻璃棒经过简单清洗可立即再次使用,环保和经济性能强于毛细管。

(4)薄层色谱有边缘效应的问题,受气温、湿度等的影响也比较大。即使前期工作都顺利完成,在展开过程中仍然可能因为斑点的移动路径倾斜而影响判断。见图1(实际照片)。在实践中发现,倾斜的角度和原点离边缘的远近有关,离边缘越近倾斜角度越大,点在中间的斑点几乎不倾斜。因此,最简单的办法就是使用宽板,然后在靠近中间的位置点上斑点。但是这样做不仅浪费板,而且没有真正去除边缘效应的影响,只是减小了影响。可行的办法是在裁剪硅胶板的过程中注意剪刀的使用技巧,而且剪好后待使用的板最好半密封,既不要完全暴露在空气中也不要放入干燥器。有文献建议完全密封,放入有蓝色硅胶的干燥器中,但是结合实际考虑,在合成中应用不是很方便,也确实没有必要;若是应用在分析等要求严格的方面,这样做还是必要的。剪好后的板尽量在3日内使用,否则硅胶板的边缘效应更强,而且吸收实验室空气中的复杂成分后,会使硅胶板表面变黄,甚至在紫外灯下可以显色。

(5)本文的介绍重点在于实际操作和经验总结,关于薄层色谱的理论研究有书籍作过详细介绍,本文不涉及。此外,在展开剂选择方面,有文献介绍了不同种类的样品使用不同的展开剂 ,建议在工作、研究中根据实际需要进行选择,有时候可以把一些常用的展开剂比例稍微变化以后再应用。有些其他不溶于水的有色物质的合成,如有机颜料的合成也可以使用薄层色谱法来控制终点。总之,要充分发挥薄层色谱灵活多变的特点^[1]。

5参考文献

[1]周鑫.薄层色谱在燃料合成中的应用实例[A].China Academic Journal Electronic Publishing Home.2007，44(6):50-53.

[2]李振江.小型薄层色谱技术及其在脂肪衍生多元醇合成反应监控中的应用.新疆工学院学报.2000,21(2):104-107.

[3]http://edu.emuch.net/bbs. 影响薄层色谱展开的因素.

[4]http://edu.emuch.net/bbs. 薄层色谱经验总结.