实验报告

一、 实验名称：蔬菜叶中色素的提取及分离

二、 实验目的：

1. 了解绿色蔬菜叶中色素的提取方法。

2. 学习纸色谱分离技术。

3. 学习色谱柱的填装及分离技术。

三、 实验原理：

1. 天然色素不溶于水，但易溶于乙醇、石油醚等有机溶剂中，因此可用有机溶剂将色素提取和分离。

2. 分配型色谱：分配色谱利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者担体表面。分配色谱过程本质上是组分分子在固定相和流动相之间不断达到溶解平衡的过程。

3. 纸层析法属于分配型色谱，其原理是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂作为流动相，色素在两相溶剂间不停地分配。由于样品中各物质有不同的分配系数，移动速度因此而不同，从而达到分离的目的。

4. 吸附性色谱：吸附色谱利用固定相吸附中心对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。

5. 柱色谱属于吸附性色谱，其原理为：由于吸附剂对各组分的吸附能力不同，当流动相流过固体表面时，混合物各组分在液-固两相间分配。吸附牢固的组分在流动相分配少，吸附弱的组分在流动相分配多。流动相流过时各组分会以不同的速率向下移动，吸附弱的组分以较快的速率向下移动。随着流动相的移动，在新接触的固定相表面上又依这种吸附-溶解过程进行新的分配，新鲜流动相流过已趋平衡的固定相表面时也重复这一过程，结果是吸附弱的组分随着流动相移动在前面，吸附强的组分移动在后面，吸附特别强的组分甚至会不随流动相移动，各种化合物在色谱柱中形成带状分布，实现混合物的分离。当以氧化铝作为固定相时，非极性或弱极性有机物只有范德华力与固定相作用，吸附较弱；极性有机物同固定相之间可能有偶极力或氢键作用，有时还有成盐作用。有机物的极性越强，在氧化铝上的吸附越强。选择适当极性的展开剂能使各种有机物按先弱后强的极性顺序形成分离带，流出色柱。

四、 实验用品：

新鲜菜叶、无水乙醇、石油醚、氧化铝、丙酮

研体、剪刀、小漏斗、量筒、具塞试管、多个锥形瓶、滤纸、毛细管、滴管、棉花、烧杯、玻璃棒

五、 实验步骤及现象：

1. 称取5g新鲜菜叶，用剪刀剪碎后置于研体中，捣成菜泥。

2. 用10ml无水乙醇变加边研磨，研磨成浆；然后再加10ml石油醚，边加边研磨—

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10. —研体中的浆液呈现深绿色。 将小漏斗放在一个锥形瓶上，漏斗内填入少许棉花，用一次性滴管吸取研体中的绿色叶浆，注入漏斗中，过滤。然后用滴管吸取锥形瓶中的下层乙醇溶液，注入废液缸——得到深绿色的色素-石油醚溶液。 取一条剪好的滤纸条，在滤纸末端1.5cm处斜剪去两侧。在距滤纸末端1.5cm处用铅笔画一条细线，然后用毛细管吸取锥形瓶中的绿色液体，沿着铅笔细线均匀地划出一条滤液细线，待溶剂挥发后，重复4-5次。 将具塞试管竖直固定在铁架台上，根据滤纸条长度，向试管中加入适量的石油醚-丙酮溶液（石油醚：丙酮=9:1），使得滤纸条下端可浸入混合溶液中，而且滤液细线不会接触混合溶液。 将滤纸条挂在管塞的小钩上，伸入试管中，使其下端浸入混合溶液，色素开始分离。待四种色素完全分开后，取出滤纸条，用铅笔画出混合溶液前沿，并且标注各条色带的中间位置，计算比移值——共有4条色带，自上而下分别呈现橙黄色（β-胡萝卜素）、黄色（叶黄素）、蓝绿色（叶绿素a）、黄绿色（叶绿素b）。 将层析柱固定在铁架台上，向其中加入约柱高1/2的石油醚。取大约9-10g的氧化铝于50ml烧杯中，加入15ml石油醚，搅拌后缓缓倒入柱内，同时打开活塞，让石油醚流下，循环几次，使得氧化铝都进入柱内，然后使氧化铝慢慢沉降。加完后用玻璃棒轻敲层析柱，使氧化铝填装紧密且均匀，并使柱面平整。然后放一个小圆滤纸于柱内，覆盖在氧化铝表面，当石油醚降至里滤纸面一上1mm处，关闭活塞。 用滴管吸取锥形瓶中的剩余溶液全部滴入层析柱中，打开活塞，让液面降至离滤纸面1mm处，滴加石油醚-丙酮溶液（9：1）进行洗脱。打开活塞，让洗脱液逐渐流下，当橙黄色色带流至柱底时，用一干净锥形瓶收集第一色带。 然后用石油醚-丙酮溶液（1：1）洗脱，用2个干净的锥形瓶分别收集蓝绿色的色带和黄绿色的色带——三个锥形瓶中的液体依次呈现出橙黄色（β-胡萝卜素）、蓝绿色（叶绿素a）、黄绿色（叶绿素b）。 整理仪器。

六、 实验数据：

前沿距滤液细线的距离a=11.45cm

β-胡萝卜素距滤液细线的距离b1=10.20cm

叶黄素距滤液细线的距离b2=7.30cm

叶绿素a距滤液细线的距离b3=5.30cm

叶绿素b距滤液细线的距离b4=2.45cm

比移值：

R（β-胡萝卜素）= b1 /a=0.89

R（叶黄素）= b2 /a=0.64

R（叶绿素a）= b3 /a=0.46

R（叶绿素b）= b4 /a=0.21

七、 讨论与感想：

1. 用纸层析法提取并分离色素的实验在高中时就已经学过，但是当时并没有进行过实

验，其原理和结果主要是依靠记忆。但是经过这次实验之后，不但对实验结果有了一个更深刻的认识，而且通过上网查找资料，弄清楚了纸层析法的原理，不仅仅是因为不同色素在石油醚-丙酮溶液中的溶解度不同，还与纸带上的结合水（固定相）

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6. 对不同色素的固定程度不同有关。 通过本次实验，我知道了不同溶剂是有极性大小差别的，乙醇中因为有氢键，所以是极性较大的有机溶剂，而石油醚是极性较小的有机溶剂。极性大的溶剂可以同时溶解极性大和小的溶质，而极性小的溶剂只能溶解极性小的溶质。所以在步骤2中依次加入两种溶剂，最终就可以得到只含有四种色素的石油醚溶液。 丙酮是极性较大的溶剂，通过和石油醚的不同配比，可以根据极性从小到大的顺序依次洗脱出β-胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b。 对于分离之后的纸色谱，我发现色素带的两端很不整齐，可能是因为以下几点原因：（1）在划滤液细线的时候没有做到均匀划线，使得不同位置的色素浓度不同，导致了同一色素带宽的差异。（2）在向具塞试管中加入石油醚-丙酮溶液的时候，有少量混合溶液沾在试管壁上，然后放入纸带的时候，纸带边缘接触试管壁，混合溶液就被纸带吸收，使得之后的色素随溶液的移动受到影响。 查找资料得知，极性越小的物质越易被洗脱，所以根据纸带便可以判断4种色素的极性大小关系：β-胡萝卜素<叶黄素<叶绿素a<叶绿素b。纸带上色素宽度代表色素含量，但是由于色素边缘不整齐，所以仅凭观察难以准确判断色素含量的大小关系。不过，叶黄素的色素带宽很窄，说明其含量很少，所以在柱层析分离的时候，并没有得到叶黄素。 色谱柱是本次实验用到的一个新仪器，通过这次实验，我学到了一种新的物质分离

技术——柱色谱分离技术，了解到它属于吸附性色谱，其原理与纸色谱是不同的。柱色谱适用于分离大量的混合有机物，而且能够方便地对分离出的有机物进行收集。

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第二篇：植物组织叶绿素的提取及分离

植物组织中叶绿素的提取及分离

一、实验目的

1、通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法；

2、通过柱色谱和薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。

二、实验原理

绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。

叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg)，其差别仅是a中一个甲基被b中的甲酰基所取代。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a的含量通常是b的3倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。

胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即a-,β-和γ-胡萝卜素，其中β-异构体含量最多，也最重要。在生物体内，β-体受酶催化氧化即形成维生素A。目前β-胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素A使用，也可作为食品工业中的色素。

叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。

本实验从菠菜中提取上述几各色素，并通过柱层析进行分离。

三、主要仪器与试剂

仪器：研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶、直形冷凝管、层析缸

试剂：硅胶G，中性氧化铝，甲醇，石油醚（60-90℃），丙酮，乙酸乙酯，菠菜叶。

四、实验流程

五、操作步骤

1、菠菜色素的提取

称取2g洗净后的新鲜（或冷冻）的菠菜叶，用剪刀剪碎并与10mL甲醇拌匀，在研钵中研磨约5min然后用布氏漏斗抽滤菠菜汁，弃去滤渣。

将菠菜汁放回研钵，每次用10mL 3:2（体积比）的石油醚-甲醇混合液萃取两次，每次需加以研磨并且抽滤。合并深绿色萃取液，转入分液漏斗，每次用5mL水洗涤两次，以除去萃取液中的甲醇。洗涤时要轻轻旋荡，以防止产生乳化。弃去水-甲醇层，石油醚层用无水硫酸钠干燥后滤入圆底烧瓶，在水浴上蒸去大部分石油醚至体积约为1mL为止。 

2、柱层析

在层析柱中，加3cm高的石油醚。另取少量脱脂棉，先在小烧杯用石油醚浸湿，挤压以驱除气泡，然后放在层析柱底部，轻轻压紧，塞住底部。将3g层析用的中性氧化铝（150~160目），从玻璃漏斗中缓缓加入，小心打开柱下活塞，保持石油醚高度不变，流下的氧化铝在柱子中堆积。必要时用橡皮锤轻轻在层析柱的周围敲击，使吸附剂装得均匀致密。柱中溶剂面由下端活塞控制，既不能满溢，更不能干涸。装完后，上面再加一片圆形滤纸，打开下端活塞，放出溶剂，直到氧化铝表面溶剂剩下1~2mm高时关上活塞（注意！在任何情况下，氧化铝表面不得露出液面）。

将上述菠菜色素的浓缩液，用滴管小心地加到层析柱顶部，加完后，打开下端活塞，让液面下降到柱面以上1mm左右，关闭活塞，加数滴石油醚，打开活塞，使液面下降，经几次反复，使色素全部进入柱体。

待色素全部进入柱体后，在柱顶小心加洗脱剂—石油醚-丙酮溶液9:1（体积比）。打开活塞，让洗脱剂逐滴放出，层析即开始进行，用锥形瓶收集。当第一个有色成分即将滴出时，取另一锥形瓶收集，得橙黄色溶液，它就是胡萝卜素。

用石油醚-丙酮7:3（体积比）作洗脱剂，分出第二个黄色带，它是叶黄素（1）。再用丁醇-乙醇-水3:1:1（体积比）洗脱叶绿素a（蓝绿色）和叶绿素b（黄绿色）。

六、注释

（1）叶黄素易溶于醇而在石油醚中溶解度较小，从嫩绿菠菜得到的提取液中，叶黄素含量很少，柱色谱中不易分出黄色带。

七、思考题

1、试比较叶绿素、叶黄素和胡萝卜素三种色素的极性，为什么胡萝卜素在层析柱中移动最快？