菠菜色素的提取和色素分离

曾丽兰

（山西大学 化学化工学院 山西 太原 030006）

摘要：在用抽滤法提取色素的过程中，由于抽滤时不好控制，非极性溶剂难免会被抽去，且在几次转移中损失较多，程序繁杂．用浸泡法操作简便易行，损失少，产率高。故在实验中采取了浸泡法提取色素，使用薄层色谱、柱色谱对叶绿素、胡萝卜素和叶黄素进行了分离。薄层层析时使用了石油醚-丙酮=8:2，石油醚-乙酸乙酯=6:4的两种不同展开剂，对比展开效果。在柱层析时，用不同洗脱剂分离得到不同物质，结果证明石油醚-丙酮=9:1做洗脱剂分离胡萝卜素效果最好。将得到的胡萝卜素进行紫外光谱测定，检验实验成果。

关键词：菠菜色素；提取；分离;胡萝卜素；紫外光谱测定

绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。

叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg))，差别仅是a中一个甲基被b中的甲酰基所取代。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂，也是食用的绿色色素，可用于糕点、饮料水等中，添加于胶姆糖中还可消除口臭。植物中a的含量通常是b的3倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于石油醚等一些非极性溶剂。

胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体α—，β—,和γ—胡萝卜素，其中β—异构体含量最多，也最重要。生长期较长的绿色植物中，异构体中β—的含量多达90％。β—具有维生素A的生理活性，其结构是两分子维生素A在链端失去两分子水结合而成。生物体内，β—体受酶催化氧化即形成维生素A。目前，β—体可作为维生素A使用，也可作为食品工业的色素，β一胡萝卜素还有防癌功能。

叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，在光合作用中能起收集光能的作用。在绿叶中通常是胡萝卜素的两倍。较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。

由此可见，叶绿素等天然色素有广泛的用途，对于色素的提取与分离就显得很重要了．本实验就提取和分离做了相关的研究。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：研钵、分液漏斗、显微载玻片、毛细管、层析柱(20×10 cm)、UV-240紫外分光光度计

   试剂：石油醚、乙醇(95%)、菠菜叶、丙酮(化学纯)、乙酸乙酯(化学纯)、无水硫酸钠、硅胶G、中性氧化铝(150目～160目)

1.2 提取与分离

1.2.1 浸泡法提取色素

在研钵中放入10 g新鲜的菠菜叶，加入20 mL3：2(体积比)石油醚—乙醇混合液，适当研磨(不要研成糊状，否则会给分离造成困难)，用倾析法将提取液转移到分液漏斗中，每次用10ml水洗涤两次,以除去萃取液中的乙醇。洗涤时要轻轻旋荡，以防乳化。弃去水乙醇层，石油醚层用无水硫酸钠干燥，干燥后滤入小圆底烧瓶，在水浴上蒸发浓缩至大约l m L。

1.2.2 薄层层析

取四块显微载玻片，硅胶G经0.5％羧甲基纤维素钠调制后制板，在室温下晾干后在110°C活化1h。选取效果最好的一块进行点样。

展开剂：（1）石油醚—丙酮=8:2（体积比）

        （2）石油醚—乙酸乙酯=6:4（体积比）

取活化后的层析板，点样，放入预先选定展开剂的广口瓶。瓶的内壁贴一张高5cm，绕周长4／5的滤纸，下部浸入展开剂中，盖上瓶盖。待展开剂上升至规定高度时，取出层析板，晾干，做出标记。

分别用两种展开剂展开，比较不同展开剂的展开效果。观察斑点在板上的位置并排列出胡萝卜素、叶绿素和叶黄素的Rf值的大小。注意更换展开剂时，需干燥层析瓶，不允许前一种展开剂带入后一系统。

1.2.3 柱层析

取少量脱脂棉在小烧杯中用石油醚浸润后，挤压除去气泡，放在层析柱底部。在层析柱中加15cm石油醚。加入中性氧化铝8克，打开柱下活塞，保持石油醚高度不变，氧化铝在柱子中堆积。装完后，打开下端活塞，放出溶剂，直到氧化铝表面剩下1—2mm高为止（不能使氧化铝表面露出液面）。

将浓缩液用滴管加到柱顶部，打开下端活塞，让液面下降到柱面以下1mm,关闭活塞，加数滴石油醚，打开活塞，使液面下降，几次反复，使色素全部进入柱体。

在柱顶加1.5cm洗脱剂——9：1（体积比）石油醚—丙酮。打开活塞，用锥形瓶收集。当第一个有色成分即将滴出时，取另一锥形瓶收集，得橙黄色溶液，即胡萝卜素。

1．3β—胡萝卜素的紫外光谱鉴定

将橙黄色试样稀释后加到1cm的比色皿中，以石油醚做空白试剂，用分光光度计测定400—600nm范围内的吸收，指出测定的λmax值。

2.结果与讨论

2.1提取

由于甲醇与乙醇的极性相近，但是乙醇易得、无毒，所以用3：2的石油醚一乙醇通过浸泡的方法提取菠菜色素，而不是用石油醚—甲醇。

2.2分离

薄层层析

薄层层析又叫薄层色谱，是色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固—液吸附色谱，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，可以用于少量样品（几到几微克，甚至0.01微克）的分离。实验中涉及的菠菜色素的比移值(Rf)（薄层色谱法中原点到斑点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值）列表如下

菠菜色素的比移值(Rf)

在一定的色谱条件下，特定化合物的Rf值是一个常数，因此有可能根据化合物的Rf值鉴定化合物。

菠菜色素中各种色素的比移值Rf大小为：胡萝b素> 叶黄素>叶绿素，按此顺序它们的非极性依次减弱。物质极性的判断为柱层析中洗脱剂的选择提供了参考价值。

柱层析

胡萝卜素极性最小，因此胡萝卜素的洗脱剂用极性较小的9：l的石油醚-丙酮溶剂效果较好。但要收集其他几种色素得换用其他的洗脱剂，因为色素的极性各不相同，且有一定差别。如用7：3石油醚-丙酮分离叶黄素．分离出胡萝卜素和叶黄素后，可加大溶剂极性以较快速度洗脱叶绿素．用3：1：1的丁醇-乙醇-水洗脱剂洗脱叶绿素。

2.3 紫外光谱测定

胡萝卜素的参考数据为481(123027)，453(141254)，实验所测数据与此有差距，可能是系统误差所导致。有关紫外光谱情况见紫外光谱如下

3.结论

采用浸泡法提取色素比抽滤法更好。在薄层层析时，用石油醚-丙酮=8:2时，能更明显的看到分层。在柱色谱洗脱剂的选择上，基于薄层分析的极性判断选择了石油醚-丙酮=9:1的溶剂作为洗脱剂，取得了非常好的效果。通过实验，进一步认识到洗脱剂在柱层析中的重要性。

参考文献：

1.兰州大学、复旦大学化学系有机化学教研室．有机化学实验(第2版)I-M3．北京：高等教育出版社，1994

2.王福来．有机化学实验[M]．武汉：武汉大学出版社，2001

           Abstract and Separate of Spinach Pigment

                      Zeng Li-lan

        (School of Chemistry and Chemical Engineering rShanxi University，Taiyuan 030006，China)

[Abstract] Pigment was abstracted from the leaves of spinach．The chorophyll carotene and xanthophyll were separated by using TLC and Column Chromatography．It was found that the petroleum ether—ethanol(3：2)immersed method is a good method and the selection of washing agent is the key of separating the pigment．

[Key words]extract；separate；ultraviolet；spinach pigment

基础有机化学实验

菠菜色素的提取和色素分离

 

第二篇：菠菜叶片叶绿体的提取实验设计

菠菜叶片叶绿体的提取

一、实验目的：

用简单的方法制备完整的叶绿体，且使得叶绿体的获得率较高。通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理与方法。了解差速离心特点与用途。

二、实验原理：

将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法，一个颗粒在离心中的沉降速率取决颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有。在一给定的离心中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分，即为差速离心法。

叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿受到损伤。将匀浆液在1500r/min的条件下离心5min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3500r/min的条件下离心510in，即可获得沉淀的叶绿。

三、实验对象：

提取新鲜的菠菜叶片的叶绿体。

四、实验条件：

实验材料：新鲜的菠菜叶片，一般选取刚见太阳不久的菠菜叶，以叶片挺厚嫩为佳。

实验器材：

普通离心机、研钵、粗天平、显微镜、烧杯、量筒、滴管、离心管、纱布、载玻片和盖玻片。

实验试剂：

0.35mol/L NaCl溶液。

五、实验步骤：

1) 选取新鲜的嫩菠菜叶片，洗净擦干后去除叶脉，称30g，剪碎放入研钵中，加入150mL 0.35mol/L NaCl溶液。在冰浴下用研钵匀浆（把研钵放在冰袋上研磨即可）。

2) 用2层纱布过滤未被研磨的碎片，去碎片。再用8层纱布过滤去细胞，以烧杯收集。

3) 将滤液转至离心管在1500r/min下离心5min，取上清液。

4) 将上清液在3500r/min下离心10min,弃上清液，沉淀即是叶绿体

5) 将沉淀浮于少量0.35mol/L NaCl溶液中，制成叶绿体悬液。

6) 取叶绿体悬液一滴滴在载玻片上，加盖玻片后在显微镜下观察。

六、实验结果预测及分析

我们可以在低倍显微镜下观察到绿色橄榄型的叶绿体颗粒，在高配镜下可看到叶绿体均匀分布，内部含有较深的绿色颗粒即为基粒。

差速离心法分离得到的叶绿体纯度不是太高，可能会对实验

观察结果造成影响，若想减小此误差，可采用密度梯度离心法。