细胞工程实验报告

专业：生物技术       班级：0801       姓名：励丹        学号：30804305

一、实验目的

1、了解动物细胞培养的相关实验器材以及实验前器材的清洗与消毒、无菌室灭菌与消毒等基本方法，以建立起无菌操作的概念。

2、了解和掌握动物细胞原代培养的基本方法，熟悉组织块法和消化法培养的基本操作过程。初步掌握无菌操作技术。

3、学习与了解细胞超低温冻存于复苏的基本原理，初步掌握培养细胞常规超低温冻存于复苏以及玻璃化超低温冻存于复苏的方法。

4、掌握ELISA测定抗体效价的方法，细胞的超低温冻存和复苏，及MTT法测定细胞活性的方法。

5、学习和掌握制备饲养层细胞的方法，为杂交瘤细胞的制备做准备。

6、学习从脾脏组织制备免疫细胞的方法，从免疫脾脏中制备免疫细胞悬液，用于杂交瘤细胞的融合。

7、学习和掌握动物细胞融合的基本方法，通过免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，并进行选择。

8、学会细胞形态的观察和分析，细胞技术等细胞培养中常见的问题。

二、实验原理

1、原代培养

    原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后直到第一次传代为止。原代培养首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织或器官，切成一定大小的组织块，直接或经消化分散成单个游离的细胞，在人工培养条件下，使其不断地生长、繁殖。

2、细胞活性测定——MTT法

MTT法是利用细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶四氮唑蓝还原成难溶的蓝紫色结晶——甲瓒，经二甲基亚砜（DMSO）溶解后，在490nm处测吸收值，其吸收值可间接反映细胞的活性状态及活细胞数量。

3、培养细胞的超低温冻存于复苏

    为了保持细胞株（系）遗传的稳定性以及非连续使用细胞的长期保存，建立了细胞超低温冻存于复苏技术。目前细胞超低温冻存技术主要有两种方法，即常规超低温冻存和玻璃化超低温冻存。

活细胞在超低温下克服了分子间的热运动，因而可长期保存而不影响活力。在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

4、饲养层细胞的制备

在体外培养细胞实验中，对于难养的细胞或者数量较少的细胞，常常需要预先在培养瓶或培养板底部加入一些活的原代细胞或者静息的肿瘤细胞以辅助目的细胞的生长，这就是饲养层细胞。它可能在饲养细胞的生长过程中会释放一些细胞生长刺激因子或提供细胞接触的信号。

5、免疫脾细胞的制备

小鼠经抗原多次免疫后，可从脾脏组织细胞分裂和分化出较多能分泌相应抗体的B淋巴细胞，脾脏内细胞连接不紧密可通过机械分离和过滤网筛选，将这些细胞制备成游离的单个细胞悬液。

6、杂交瘤细胞的制备（细胞融合）

      通过对免疫动物B细胞和某一个永久细胞系进行融合，杂交后代称之为杂交瘤。杂交瘤细胞可以将分泌特异性抗体B细胞的遗传特性和骨髓瘤细胞系体外增殖的遗传特性合二为一。一种淋巴细胞克隆只产生一种特异性抗体；细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持亲代双方的特性；杂交瘤细胞的筛选，体外培养大量增殖，获得所需抗体。

7、ELISA检测

使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 

三、实验内容

1、动物细胞培养技术

2、杂交瘤技术与单克隆抗体制备

3、细胞工程相关技术

1）动物细胞培养实验器材的准备

无菌室：首次启用的无菌室一般可采用福尔马林熏蒸（5～6m2无菌室用KMnO4 50g，倒入100ml甲醛（用搪瓷盘），冒浓烟，24hr，氨水中和至无甲醛味），经常使用的无菌室在每次实验前必须开启紫外灯照射0.5至l小时，然后避光0.5至l小时后方可进入操作。

培养器材的消毒：干热灭菌法：玻璃器皿、金属器具等的消毒方法，140～150℃，2～3小时；湿热灭菌法：橡胶制品、无菌衣、帽和口罩以及除菌过滤器的清毒，高压蒸汽灭菌15磅20—30分钟；紫外线照射灭菌：多孔培养板的灭菌－30分钟。抽滤除菌：培养基等（培养基通过0.22过滤装置－除菌）

2）杂交瘤技术与单克隆抗体制备

1、小鼠的免疫

  方法：脾脏直接注射：一般免疫后3～4天即可制备抗体。

?      其它途径注射：一般采用间隔免疫的方法，分3次，间隔2～3周进行免疫。

  步骤：取绵羊静脉血0.2mL（加肝素或枸橼酸钠抗凝）

?      用0.9％NaCl或PBS 1000~ 1500rpm离心5分钟涤洗3次，收集血细胞。

?      血球计数板计数，用0.9％NaCl或PBS调整细胞浓度至4×10⁷个/ml（10个/小格）。

?      向小鼠腹腔注射血细胞悬液0.5ml 。

每隔15天重复注射作加强免疫，共重复2次，第2次加强免疫后10天，检测血清效价，若血清效价低则要继续免疫。

?小鼠处死前2～3天加强免疫1次，以活化B淋巴细胞。

注：细胞计数：一个大方格被分成16个中方格。每一个大方格边长为1mm，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。一个大方格被分成16个中方格。每一个大方格边长为1mm，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。细胞浓度（个/ml）=细胞数/体积即：细胞浓度（个/ml）= 一个大格的细胞数×10⁴。打入的免疫红细胞数要在一定范围内，细胞数量太多会免疫耐受；太少得到的免疫细胞数少。

2、小鼠血清的制备

取五只没有免疫过的小鼠---每只小鼠眼球取血0.5mL以上于1mLEP管中----小鼠短颈处死后，放于装有75%酒精的烧杯中消毒灭菌，带入无菌室备用——取出血清放于37℃水浴保温30min——2000转离心10min——取上清于干净的离心管中，作为ELISA的阴性对照

取五只免疫过的小鼠——同上操作——取血清作为ELISA的阳性对照

3、单克隆抗体的制备流程

4、骨髓瘤细胞的培养

1、选择生长旺盛，形态良好的细胞

?2、将上清倒入离心管内，剩余贴壁的细胞用0.02％EDTA消化液消化细胞5分钟后倒入同一离心管，1000～1500rpm离心5分钟，收集细胞。

?3、加6mL含10％小牛血清的DMEM培养液悬浮细胞，分装于两个细胞培养瓶，5％CO2培养箱37℃培养。

5、饲养层细胞的制备

1、每组1只小鼠，断颈处死后浸泡在75％乙醇消毒5分钟。

? 2、在无菌室内小心剪开小鼠腹部皮肤，暴露腹腔，用注射器腹腔注射3～4ml 1640培养液，按摩片刻。

? 3、左手用镊子夹起腹腔肌肉，右手用剪刀剪开一个小口，小心用吸管吸出腹腔液体于离心管。

? 4、低速离心洗涤细胞一次后，用12~15ml 1640培养液悬浮细胞（5×104），取100~200 ?l滴96孔板（一般用吸管滴2~3滴）。

5、免疫脾细胞的制备

1.将免疫过并取完血清后的浸泡在75％乙醇中的小鼠带入无菌室。

2.小心剪开腹腔，取出脾脏。

3.用一次性注射器将脾脏刺几个洞，再吸3～4mLPBS液吹打脾脏。

4.收集吹打的细胞悬液，经低速离心洗涤后将细胞悬浮在培养液。

6、杂交瘤细胞的制备（细胞融合）

1.将骨髓瘤细胞(2×10⁷）与脾细胞按1:10的比例混合，低速离心后弃上清，用手指弹匀细胞。

2.将1mL50％的PEG在1分钟内缓缓加到混合的细胞内，注意边滴加PEG边摇动离心管。

3.PEG作用1分钟后，迅速滴加培养液终止PEG作用，低速离心洗涤细胞。

4.用10mLDEME培养液悬浮融合细胞，按每孔3滴的量滴加到含滋养层的96孔板内，置37℃5％CO2培养箱中培养。

（注：因为实验时间有限，我们只是操练单克隆抗体的制备方法和过程，并没有制备到单克隆抗体，但是单克隆抗体的制备过程和操作注意事项已经基本了解。）

3）原代细胞的培养

组织块法培养小鼠肝脏组织:

1.取出肝脏，经PBS漂洗三次后，放在表面皿中。

2.在表面皿中，用滴管加入少量PBS（RPMI1640含20％小牛血清，0.2%白蛋白，10ug/ml胰岛素，100U青霉素和链霉素）用锋利的剪刀将组织块剪成约1mm³的小块。

3.用弯头镊子将组织小块移入细胞瓶中，把它们排列成行，每块组织相距约0.5cm，每瓶细胞贴20～30小块，随即翻转细胞瓶，使贴组织块的一面朝上，然后加培养液3ml。

4．将细胞瓶置于37℃，5％CO2培养箱中静置2~4小时，然后将瓶轻轻翻转，使组织块浸入培养液中，继续静止培养。

5．72小时后在显微镜下检查，若见细胞自组织边缘长出，则继续培养3-5日，再换部分或全部培养液，待多数组织块的生长晕相接时，可进行传代培养。

肝细胞培养的实验结果：

?若培养液显为淡黄且清澈，一般显示细胞生长良好。

?培养3～5日，在相差显微镜下观察，若见细胞自组织边缘长出，更换部分或全部培养液，待多数组织块的生长晕相接，小心挑掉组织块，继续培养3～4天。

?7天左右后，生长晕扩大到直径为15mm左右小鼠肝脏细胞原代培养的生长晕是多角形上皮样细胞与梭形细胞混合的细胞群体。

?24～48小时后若培养液变成黄色且混浊，表示已被污染；

?若培养液变成紫色，一般细胞生长不好，则培养液pH过高；

消化法培养小鼠肾细胞:

1、  将消毒过的小鼠，剖腹取出肾脏于放有ＰＢＳ的培养皿中洗涤。

2、  尽量剪碎肾脏。

3、  用ＰＢＳ洗涤２～３次。

4、  加入５mL胰酶，37℃（30min）。

5、  过筛，１０００转离心１０min，用PBS洗涤2~3次。

6、  加培养液，计数至3~5×105/Ml.(1.5个每中格)。

7、  细胞悬液装瓶3mL 放于CO2培养箱培养。

4）抗体IgG ELISA检测

1.取0.2ml绵羊红细胞，加6ml PBS 1000rpm离心10min洗涤，重复一次。

2.取下层红细胞，加1.2ml磷酸盐缓冲液（Na2HPO45mmol/L, NaH2PO45mmol/L pH7.6）（低渗）混匀后，常温处理20~25min，4℃12000~13000 rpm离心15min，去上清，重复一次。

3.取乳白色沉淀（血影）用包被液稀释至后，按50g（老师制备） 加入96孔酶标板内，放于湿盒4℃冰箱过夜，备用。

4.吸去孔中的抗原液（自制吸头，这样冲击力会小，不会使包被的抗原脱落），用洗涤液洗涤3次（将洗涤液沿孔壁注入200?L/孔，放置3分钟，甩去洗涤液，重新注入），加封闭液（含1％牛血清白蛋白的洗涤液）200?L/孔，封闭30min。

5.甩去封闭液，用洗涤液3次。

6.待测抗体作1:500、1:1000、1:2500、1:5000稀释后，按每孔100uL加入，置湿盒内于37℃作用1小时。同时设阴性、阳性、空白对照（调零孔）。

7.用洗涤液3次。

8.每孔加适当稀释的酶标兔抗鼠IgG试剂100uL，置湿盒内37℃作用1小时。

9.用洗涤液3次。

10.每孔加入100uL新配制的底物溶液（TMB），暗处室温作用5-10分钟。

11.每孔加100 uL2MH₂SO₄终止反应，检测。

12.用酶联免疫检测仪测定OD450nm光吸收值，若试验孔的光吸收值比阴性孔的光吸收值大于或等于2.1，可判定为阳性。

 （注：TMB, 2MH₂SO₄操作时要带手套，TMB中有过氧化氢对皮肤有腐蚀作用。酶标板在操作过程中不能用手接触其底部，会影响折光率，在测吸光值时板底的水要擦干。）

5）细胞的超低温冻存与复苏

?1.小鼠断颈处死后，分别取肾脏（剪碎）、脾脏（注射器吹打）细胞，1000~1500rpm离心5min，收集细胞。

?2.用1640培养液悬浮细胞，计数，调整细胞密度至5×106~2 ×107个/ml，分装成3管，每管0.8ml，经以下处理后-196℃（液氮）冻存过夜。

分组：

A组：直接冻存；

B组：细胞悬浮在10％DMSO-1640培养液中冻存；

C组：细胞先经10％浓度的玻璃化保护剂处理（PVS2），4℃过渡5min，然后4 ℃1000rpm离心10min，弃上清，再用100％PVS2保护剂，4 ℃过渡5min后冻存；

（注：为了MTT法测定细胞活性比较三种方法时减小误差，按C组平行离心AB组。）

3、MTT法测定细胞活性

1.从液氮中取出冻存管，直接投入37～40℃的水浴中，并不时摇动，使其快速（1分钟之内）融化。

2.转移到1.5ml离心管后，加0.5ml 1640培养液，1500rpm离心5min，弃上清，收集细胞。

3.用0.5ml 1640培养液悬浮细胞后，再加80uL MTT反应液，37℃水浴中培养3小时。

4.1500~2000rpm离心5min，弃上清，收集细胞；再用800uL DMSO溶解细胞，按每孔200uL的量转移至96孔酶标板内，室温放置10分钟，并不时摇动，以溶解细胞。

5.无细胞组为调零孔。选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定MTT反应孔的光吸收值（OD570）

6.比较不同处理方法，细胞的存活情况。

四、实验结果及分析

1、细胞培养观察：培养液显为淡黄且清澈，无污染现象；细胞呈球状，密集

2、细胞的超低温冻存与复苏后活性检测：OD

1´-1：调零孔

2′-1、2、3、4：肾细胞直接冻存

3′-1、2、3、4：肾细胞加10%DMSO冻存

4′-1、2、3、4：肾细胞玻璃化冻存

2′-5、6、7、8：脾细胞直接冻存

3′-5、6、7、8：脾细胞加10%DMSO冻存

4′-5、6、7、8：脾细胞加玻璃化冻存

就结果而言：加10%DMSO冻存的细胞存活率最高，而理论上是玻璃化冻存的细胞存活率最高。

            从液氮中取出时玻璃化冻存也结成冰晶，与理论不符，实验存在问题。

            我们小组将两只小鼠的细胞混在一起，细胞数增多，损伤也增多。

3、ELISA检测：ＯＤ

１′－１：调零孔

１′—２、３、４、５：阴性对照               ３′－５、６、７、８：１：８０００

１′－６、７：阳性对照                       ４′－１、２、３、４：１：１６０００

２′－１、２、３、４：１：１０００           ４′－５、６、７、８：１：３２０００

２′－５、６、７、８：１：２０００           ５′－１、２、３、４：１：６４０００

３′－１、２、３、４：１：４０００           ５′－５、６、７、８：１：１２８０００

８′９′１０′１１′于２′３′４′５′相同

加入底物溶液（TMB）后，阳性孔呈蓝色，阴性孔无色；

加入终止液后，阳性孔呈黄色，阴性孔无色。

结果（OD  ）：阴性对照：０．０１６２５

          １：１０００：０．１３４７５（０．１９６２５）

          １：２０００：０．１３０５（０．１６２５）

          １：４０００：０．１３１７５（０．１２７７５）

１：８０００：０．０９５２５（０．０９５７５）

１：１６０００：０．０４５７５（０．０５８５）

１：３２０００：０．０２６（０．０３９５）

１：６４０００：０．０２５７５（０．０４７７５）

１：１２８０００：０．０１８（０．０３２７５）

１：１０００／阴性对照：８．２９２（１２．０７７）

１：２０００／阴性对照：８．０３１（１０．０００）

１：４０００／阴性对照：１０．５４（７．８６２）

１：８０００／阴性对照：５．８６２（５．８９２）

１：１６０００／阴性对照：２．８１５（３．６００）

１：３２０００／阴性对照：１．６（２．４３１）

１：６４０００／阴性对照：１．５８５（２．９３８）

１：１２８０００／阴性对照：１．１０８（２．０１５）

就结果而言：以２′３′４′５′为准：１：１６０００／阴性对照>２．１，为阳性

                              １：３２０００／阴性对照<２．１，为阴性

                              则效价为１：１６０００

           以８′９′１０′１１′为准：１：６４０００／阴性对照>２．１，为阳性

                              １：１２８０００／阴性对照<２．１，为阴性

                              则效价为１：６４０００

             实验时加液可能存在的误差或不准确，使液面有高低，影响折光率，使实验数据不准确；

             实验时手碰到了酶标板底部，留有指纹等，影响折光率，使实验数据不准确；

             测OD值时酶标板底部有水，影响折光率，使实验数据不准确

五、实验要点及讨论

1、酶联反应常见问题：

   1、显色步骤结束后，所有孔均无色，阳性对照不显色

原因：错加、漏加试剂底物、显色剂；

      洗板及加样过程中，酶标受污染失活，失去催化显色剂显色的能力；

      终止液误做洗涤液或底物溶液配制；

      蒸馏水有问题

   2、所有孔均较淡

原因：加入试剂的体积和时间有误，或移液器枪头不洁；

      洗板及加样过程中，酶标受污染失活，失去催化显色剂显色的能力；

      培养时间及温度为达到要求；

      洗板次数过多，或洗涤液不符合要求，洗涤冲击力太大，浸泡时间过久；

      底物作用时间不够

3、阴阳性对照正常，待测品未检出

 原因：样品高温放置过久，或反复冻溶致待测物浓度下降

4、出现随机性的花板、跳板现象

 原因：样品离心不完全，反应孔内发生凝血或残留细胞成分；

       加样时交叉污染；

       手工洗板时造成交叉污染；

5、假阳性

 原因：洗涤不充分，样品中有其他成分残留；

       血清标本处理不当；

       加酶量过多；

       培养温度超37度，或酶结合物反应时间或底物显色超时；

       底物或样品污染

2、细胞超低温冻存于复苏的要点

1.冷冻速度

冷冻速度也就是降温的速度，它与冷冻效果直接相关。冷冻速度、细胞收缩引起细胞膜和细胞器的变化是造成损伤的主要因素目。冷冻速度不同，细胞内水分向细胞外流动的情况也会不同。如果冷冻速度过慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，同时细胞内溶质浓度增高，细胞内不发生结冰；冷冻速度过快，细胞内水分没有足够时间外渗，随着温度的下降，细胞内会发生结冰；如果冷冻速度非常快，细胞内形成的冰晶反而非常小或不结冰而呈玻璃状凝固(玻璃化冷冻)。

不同细胞的最适冷冻速度不同，主要取决于水分渗透过程是否与降温速度相匹配；同时还取决于细胞的表面积与体积之比，以及细胞膜的渗透率。一般来说。小细胞(如红细胞等)对水通透性强，适用于快冻，最佳冷冻速率较高，可达103^oC／min或更高；相反大的细胞或组织，如直径100 m以上的胚胎，对水的通透性弱，则适于慢冻。此外，最佳冷冻速度还受是否应用防冻剂、防冻剂的含量以及培养的细胞所处的状态等多方面的因素影响。目前被普遍接受的是皮肤的低温保存中采用慢冻快复温，一般认为降温速率以1~5 ^oC／min为最佳。

2.复苏

复温速度是指在细胞复苏时温度升高的速度。冷冻保存体外培养物，除了必须有最佳的冷冻速度、合适的冷冻保护剂和冻存温度外，在复苏时也需要有最佳的复温速度，这样才能保证最终得最佳冷冻保存效果。与冷冻过程相比，复温过程的研究显得薄弱得多。

复温速度不当同样会造成细胞损伤，降低冻存细胞存活率，其损伤发生非常快，持续时间也很短。

3.冻存保护剂

冻存保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质(常为溶液)。细胞悬液中加入冷冻保护剂可保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成．同时冷冻保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。

冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂多是一些小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内。该类保护剂主要包括二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤同时。细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定时间进行预冷，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前使用较多的是DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等。

非渗透性冷冻保护剂一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内。该类保护剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉等。其保护机制的假设很多，其中一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中的水分子相结合，降低溶液中自由水的含量。使冰点降低。减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。