亲们：

       曾老师发来的实验讲义，请下载打印，每次课带相应的讲义。

       1.下周一实验1点开始，切记时间不要迟到哟。

       2.作业：第一次（今天）的实验报告，还有“大吞噬”和"小吞噬"的图。

       3.漂亮美女们要把头发扎好，为自己的健康着想哟。

实验一   小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验

【原理】吞噬细胞具有对异物(细菌、绵羊红细胞、鸡红细胞等)吞噬和消化的功能，在机体固有免疫中发挥重要作用。

【目的】

1.       通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察，加深理解细胞吞噬作用的过程及其意义。

2.掌握小鼠腹腔注射给药和摘眼球放血及脊椎脱臼处死的方法。

【材料】小鼠、2％鸡RBC（CRBC）、尖吸管、玻片、瑞氏染液、眼科剪、弯头眼科镊、1mL注射器

【方法】10％的硫乙醇酸钠溶液腹腔注射1ml（诱导腹腔巨噬细胞大量渗出）

（4d）

2％CRBC腹腔注射1ml

（45min）

摘眼球放血，处死小鼠

轻揉腹部1min，剪开表皮，暴露腹膜，剪一小口，取腹腔液（用尖吸管）滴于玻片一端

推片（自然干燥）

瑞氏染色（10min）

冲洗，印干，镜检

【注意事项】

⒈ 腹腔注射时勿注入皮下；

⒉ 染色时玻片勿互相碰触；

⒊ 观察时注意玻片正反面。

结果：吞噬百分率＝吞有SRBC的吞噬细胞/100个吞噬细胞×100％

吞噬指数＝所吞SRBC数/100个吞噬细胞

附：

⒈ 2%CRBC悬液的制备：吸取在阿氏液中保存的CRBC沉淀0.3mL，置于玻璃试管内，加入2mL生理盐水，混匀，2000rpm, 5min离心，此为洗涤红细胞。离心毕，观察上清，如无溶血现象，即可弃上清，取红细胞沉淀（即为压积红细胞）0.2mL，移入15mL离心管中，以10mL注射器吸取生理盐水10mL加入，混匀，即为2%CRBC悬液。若洗一次后仍可见溶血现象，则重复第一步，直至无溶血发生，方可配制实验用红细胞悬液。

⒉ 摘取胸腺，脾脏。均为重要的免疫器官，做动物实验获取免疫细胞的重要来源

示教片：

大吞噬实验：即本实验结果；

小吞噬实验： 外周血嗜中性粒细胞吞噬葡萄球菌（标本片示教）

实验二  淋巴细胞转化实验（MTT法）

一、原理：

     四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。

二、材料：

小鼠、鼠板、眼科剪、眼科镊、75%乙醇湿棉球、小平皿、200目筛网、研棒（注射器针芯）、细胞计数板、盖玻片、加样器（1mL、200uL、20uL）及枪头、96孔血凝板、15mL离心管、4mL EP管、96孔板、白细胞计数液、MTT、ConA、无菌PBS、Tris-NH₄Cl、完全1640(含10% FBS、1%双抗)、0.01N HCl-10%SDS、无菌针头过滤器、10mL注射器、废物（液）缸、冰浴、无菌操作台、CO₂培养箱，显微镜、酶标仪，冰箱、低温离心机。

试剂的准备：

1. MTT：称取50mg的MTT，溶于10ml PBS后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，1mL/管，-20℃避光保存。

2. ConA：25mg/瓶，Sigma出品。取25mg，溶于25mLPBS中，终浓度为1mg/mL，过滤除菌，无菌EP管分装，1mL/管，-20℃保存。用时取1mL，以无菌PBS稀释为100ug/mL（即稀释10倍）。

3. PBS：取市售配好的PBS粉末一袋，加1000mL蒸馏水，混匀，高压或过滤除菌，4℃保存。

4. 0.01N HCl-10%SDS：设市售浓HCl为10N（实际约为11N），取0.1mL加99.9mL蒸馏水稀释为0.01N HCl 100mL；称取10g SDS，置于100mL量筒内，以上述HCl溶解，使终体积为100mL，即得0.01N HCl-10%SDS。

5. 完全1640:取市售RPMI1640 89mL，加1mL 100×双抗、10mLFBS，即得含10%FBS的完全1640.

6. Tris-NH4Cl（红细胞裂解液）：称取3.735g氯化铵、Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.3g加水溶解并稀释至500ml。0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。

无菌器械的准备：

1. 200目筛网、研棒、平皿：提前1d高压灭菌，烘干备用。

2.手术器械：临用前酒精擦拭或浸泡、酒精灯火焰灭菌。

3.冰浴：将碎冰置于一白色浅盘(或小塑料泡沫盒)内，备用。

（三）实验方法：

1、脾细胞制备：

（1）小鼠摘眼球放血、脱颈椎处死，75%乙醇湿棉球擦拭腹部，置于鼠板上固定；

（2）在小鼠腹部中间部位剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；

（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，另一镊子分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5ml 无菌PBS液的培养皿中；

（4）制备脾细胞悬液: 无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（200目）上，置于盛有适量无菌PBS的小平皿中，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用PBS洗3次，每次离心2000r/min 5min。取出10μl，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，调整细胞浓度为5×10⁶/ml。

    细胞计数的方法：

①稀释脾细胞：在96孔血凝板内分别加白细胞计数液90μL/孔，根据细胞数量加2-3个孔；取脾细胞悬液10μL，依次10倍稀释。

②取最后1孔的细胞悬液10μL置于白细胞记数板槽内，待细胞不再移动，100倍镜下进行细胞计数。

③根据细胞计数结果，取适量细胞以完全1640稀释为5×10⁶/mL

2、淋巴细胞增殖反应： 将5×10⁶/ml脾细胞悬液加入到96孔培养板中，100ul/孔，加6个孔，再加培养液100μL/孔；前3个孔加ConA 10μL/孔(终浓度5μg/mL)，另3个孔不加ConA作为对照。置5％ CO2，37℃培养72h。

3. 在培养结束前4-6小时，先将各孔中培养液小心吸出100μL/孔，注意加样器枪头勿碰触细胞；于培养板各孔内加入5mg/ml MTT液，10μl/孔。37℃培养。

4. 4-6小时后，各孔内加入0.01NHCl-10%SDS 100μl, 振荡摇匀，37℃过夜。

5. 用酶标测定仪测OD值，测定波长570nm。抄录数据。

 （四）实验结果

取实验组和对照组三个复孔的平均OD值。

转化值=实验组的平均OD值-对照组的平均OD值。

注意事项

（1）由于本实验需要培养3天，才能观察结果。因此，在操作时应注意无菌操作，避免细菌污染，导致实验的失败。

（2）细胞操作要轻柔、迅速，以免细胞损伤影响实验结果。

（3）为保持细胞活性，所有步骤（除破坏红细胞时）均需在低温或冰浴中进行。

实验三-1  凝集实验

原理：是颗粒性抗原与相应抗体结合所发生的凝集反应(agglutination)。细菌和红细胞等颗粒性抗原，当与相应抗体特异结合后，在适量电解质存在的条件下，两者特异性结合且进一步聚集，出现肉眼可见的凝集现象称为凝集反应。反应中的抗原称为凝集原（agglutinogen），抗体称为凝集素（agglutinin）。

分类：直接凝集试验、间接凝集试验、间接凝集抑制试验等

    血球凝集试验：属直接凝集试验

材料：1％SRBC、1：20溶血素、生理盐水（NS）、24孔凹孔板、0.2mL加样器及枪头、37℃恒温箱

方法与步骤：对倍稀释法（第12孔为阴性对照，37℃，2h，4 ℃静置过夜

                   1     2     3     4     5。。。。。。。。。。。。11  12

生理盐水（ml）    0.2   0.2    0.2

溶血素（ml）      0.2   0.2    0.2                        弃去

               1：40  1：80  1：160

1%SRBC（ml）    0.2   0.2    0.2

结果判定：＋＋＋＋ 全部凝集，血细胞明显凝集，甚至成片卷曲，上清清亮

          ＋＋＋   两者之间，血细胞凝集成片，上清发红，略不清亮

          ＋＋     一半凝集，一半沉淀，血细胞均半数凝集，周围散在颗粒，上清呈混悬

          ＋       两者之间，血细胞在孔底形成一圆点，周围可见少量凝集，上清更加浑浊

          －      一点儿也不凝集，血细胞在孔底形成边缘整齐，光滑的点状，上清澄清

效价：即滴度，是出现明显凝集现象（＋＋）的抗体的最大稀释度。

实验三-2  抗体形成细胞检测――溶血分光光度计法QHS

实验原理：定量溶血分光光度法(quantitative hemolysis spectrophotometry，QHS) 该法又称B细胞介导的红细胞定量溶血分光光度法，是根据溶血空斑试验的原理衍化而来，可用以测定由B细胞产生和分泌的抗体裂解红细胞所释放的血红蛋白(以吸光值表示)，从而反映机体的体液免疫功能。试验时，将免疫的脾细胞与SRBC及新鲜豚鼠血清等体积混合，于37℃水浴1小时，离心后测上清吸光值，其与产生抗体的量成正比。

实验材料：5%SRBC、SRBC（以生理盐水稀释成1.5×10⁸/ml）、

补体（三只豚鼠血清混合，以SRBC 4℃ 吸收 30 min，3000rpm离心15min，上清 1:10 稀释备用）

2×10⁷/ml 小鼠脾细胞、RPMI1640培养液、白细胞计数液、Tris-NH4Cl溶液、酒精棉球

200目铜网、针芯（研棒）、冰浴（置于中号白托盘中）、眼科剪、弯头眼科镊2把、平皿（小号）、小滤器、10mL注射器、PBS、低温离心机、15mL离心管、1.5mL离心管若干、96孔血凝板（稀释细胞用）、96孔酶标板、各规格（1mL、200uL、10uL）加样器及枪头、显微镜、血球记数板、盖玻片、废物（液）缸、37℃孵箱、酶标仪

实验方法：

1. 脾细胞的制备

     ①5%SRBC免疫小鼠，1mL/只，4天后拉颈处死，取脾

②200目铜网上研磨脾脏，收集脾细胞悬液，2000rpm离心5min，弃上清

     ③Tris-NH₄Cl室温作用10min，2000rpm 离心 5min,弃上清

     ④洗细胞2遍：加5ml PBS 液，混匀，2000rpm 离心 5min，弃上清                      

⑤加 1 ml PBS液计数，调整细胞浓度为2×10⁷/ml

按下表分别向各管中加入所需材料

?    混匀，37℃ 孵育 1 h

?    3000rpm 离心 5 min，取上清，加入96孔板，0.1mL/孔，实验组和对照组各设3个复孔

?    酶标仪测定413nm处OD值（Hb量）

实验四

实验五  免疫细胞化学

实验原理：　应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immuno­cytochemistry)。

免疫酶标记法：以酶作为标记物与外加底物作用后产生不溶性色素，沉积于抗原和抗体反应的部位；

　　· 酶降解底物的量与色泽浓度成正比。可反映被测定的抗原或抗体的量。

　　1、常用的标记酶及其显色底物

　　· 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)及底物

　　· 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)及底物

　　(1) 辣根过氧化物酶(HRP)及底物

　　· HRP是应用最广的一种酶，来源于植物辣根，由无色的酶蛋白和深棕色的铁叶琳结合而成，分子量约40kDa，稳定性好；

　　· 底物为过氧化物和供氢体(DH2)

　　– 过氧化物：常用过氧化氢和过氧化氢尿素。

　　– 供氢体：多用无色的还原型染料，通过反应生成有色的氧化 型染料，最常用的供氢体是DAB。

　　DAB (二氨基联苯胺)

　　· DAB本身无色，反应后呈棕色，不溶于水，不易褪色，电子密度高，最为常用。

　　· 目前已经有商品化的试剂盒，使用起来非常方便。

　　(2) 碱性磷酸酶(AP)及底物

　　· AP为磷酸酯的水解酶，可通过两种反应显色：

­- 偶氮偶联反应，底物为a-萘酚磷酸盐，经水解后得a-萘酚，与重氮化合物如坚牢蓝(fast blue)或坚牢红(fast red)形成不溶性沉淀，分别呈兰色或红色。

– 靛蓝-四唑反应：底物为溴氯羟吲哚磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indodyl phosphate,BCIP)，经酶水解并氧化形成靛蓝，而氮蓝四唑(NBT)在此氧化过程中被还原成不溶性紫兰色沉淀。

酶标抗体法

　　· 通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，与标本进行反应后，再用酶组化法将酶显色，使之生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，以供光镜和电镜观察。

　　– 优点：切片能长期保存、反复观察，适于镜下半定量分析。

　　– 缺点：酶与抗体形成的共价键，可损害抗体和酶的活性；易产生非特异染色。

　　(1)直接法

　　· 将酶直接标记在一抗上，然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物，最后用底物显色剂显色。

　　(2)间接法

　　· 将酶标记在二抗上，先将一抗与相应的抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗(酶标抗体)与复合物中的特异抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。

实验材料：1×10⁷/ml 小鼠脾细胞、单抗（兔抗鼠CD3）、兔Streptavidin-HRP试剂盒（带DAB显色液）、小牛血清、淋巴细胞分层液（适用于小鼠组织）、白细胞计数液、酒精棉球、200目铜网、针芯（研棒）、冰浴（置于中号白托盘中）、眼科剪、弯头眼科镊2把、平皿（小号）、PBS、低温离心机、15mL离心管、96孔血凝板（稀释细胞用）、各规格（1mL、200uL、10uL）加样器及枪头、显微镜、血球记数板、盖玻片、废物（液）缸、37℃孵箱、湿盒

实验方法：

1. 单个脾细胞的制备

     ① 取健康ICR小鼠，18-22g，摘眼球放血、脱颈椎处死，取脾

② 200目铜网上研磨脾脏，收集脾细胞悬液，2000rpm离心5min，弃上清

     ③ 用PBS洗3次，每次以500 rpm短时低速离心除去细胞碎片，以200目不锈钢滤网过滤去除细胞团块。作细胞计数并调整细胞浓度为(2～5)×10⁷/ml。常温下放置，分离前用小牛血清悬起细胞浓度为l×10⁷/ml的单细胞悬液备用。

    2. 分离单个核细胞

①取上述单细胞悬液1ml，小心加于2ml的细胞分离液之液面上

②以2000转/分离心(半径15cm水平转子)15分钟，此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层；为胎牛血清液层。第二层；为环状乳白色淋巴细胞。第三层；为透明分离液层。第四层；为红细胞层。

③收集第二层细胞放入含PBS 4-5毫升的试管中，充分混匀后，以2000转/分离心5分钟。沉淀经反复洗2次即得所需细胞。

附：

1. 有关淋巴细胞分层液的注意事项:

1）启封后应置4℃保存避免微生物的污染。

2）细胞分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，摇匀后使用。

3）整个分离过程中，温度应控制在18-28℃且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量。

    2. 细胞计数要点：

1）进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于l0⁴个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；显微镜下计数时，遇到2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如果细胞团>10％，说明细胞分散不充分；或细胞数<200个/10mm²或>500个/10 mm²时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。

2）要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。

3）取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其是多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，  以求计数准确；

4）数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。

5）操作时，注意盖玻片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。

3. 免疫细胞化学染色

1) 试剂盒组成：

2) 染色方法：

①固定细胞：取上述分离好的淋巴细胞50μL，滴于载玻片正中，以细菌接种环均匀涂于载玻片上，自然干燥后，以纯甲醇室温固定5min，再用0.01M PBS漂洗，5min×3；

    ②滴加适量试剂1(内源性过氧化物酶封闭液)，室温孵育10分钟，PBS充分淋洗。

    ③滴加适量试剂2(封闭用正常羊血清工作液)，室温孵育10分钟，甩干。

④滴加适量—抗工作液( PBS 1:50稀释)，37℃孵育1h，然后PBS充分淋洗。

⑤滴加适量试剂3(生物素标记羊抗兔二抗工作液)，室温孵育10分钟，PBS充分淋洗。

⑥滴加适量试剂4(HRP标记的链霉亲和素)，室温孵育10分钟，PBS充分淋洗。

⑦DAB显色工作液配制：根据需要量，将试剂A和试剂B以1：19的体积比混匀后即为DAB显色工作液。也可选择每毫升试剂B中滴加1滴(约50μ1)试剂A，混匀即可。

⑧显色：加适量的DAB显色工作液于需要显色的组织切片或细胞爬片上即可显色，显色时间—般为1～5分钟。显微镜下观察控制显色时间，当达到最佳显色效果后，自来水冲洗终止显色。显色后的切片经复染、脱水透明，封片后可长期保存。

实验六  细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC PI双染法)

(Assay of Cell Apoptosis)

一、实验原理

细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine， PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶（Propidium Iodine,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin-Ⅴ就PI匹配使用，就可将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

二、实验仪器和材料

Annexin V-FITC（膜联蛋白-V-FITC）

标记缓冲液（Binding Buffe）10ml

PBS（1×）

20μl , 200μl , and 1000μl 移液器和吸头

微量离心管

可调速离心机

载玻片（用于荧光显微镜观察）

盖玻片（用于荧光显微镜观察）

去离子水

冰块

荧光显微镜

三、实验方法

1．凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。用PBS洗两遍，调整待测细胞的浓度为2 ×10⁶/ml，备用。

2．将细胞重悬于200μl 标记缓冲液（binding buffer）。

3．加入10μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，再加入5μlPI，混匀。

4. 避光室温反应15分钟。

5. 滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。

6. 请在1h内，进行荧光显微镜的观察。Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。

四、 实验结果

用荧光显微镜观察，凋亡细胞细胞膜上可见黄绿色光环。PS转移到细胞膜外不是凋亡所特有的，也可发生在细胞坏死中。以FITC标记的Annexin V, 可以同时结合使用PI(碘化丙啶)拒染法，用流式细胞仪分析可检测凋亡细胞的百分率。

五、注意事项

1．整个操作过程动作要尽量轻柔，切勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作。

3．反应完毕后要尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应一小时后荧光强度就开始衰变。

4． Annexin V-FITC是光敏物质，在操作时要注意避光。