荧光素酶及其报告基因的应用和检测

一 生物发光

生物发光（bioluminescence）是指生物体发光或生物体提取物在实验室中发光的现象。它不依赖于有机体对光的吸收，而是一种特殊类型的化学发光，化学能转变为光能的效率几乎为100%。也是氧化发光的一种。生物发光的一般机制是：由细胞合成的化学物质，在一种特殊酶的作用下，使化学能转化为光能。

与荧光的区别在于

荧光：荧光检测需要激发光源，发射光的能量来源于激发光，荧光反应为瞬时反应。 发光：生物发光、化学发光，发光反应无需激发光源，发射光的能量来源于化学反应，发光有一定的持续时间。

二 荧光素酶

荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称,来自于自然界能够发光的生物。

自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。细菌荧光素酶对热敏感,因此在哺乳细胞的应用中受到限制。目前,以北美萤火虫虫(Photinus pyralis)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛,该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个61kDa的单体酶，无需表达后修饰，直接具有完全酶活。 发光机制

生物荧光实质是一种化学荧光。萤火虫荧光素酶在Mg2+ 、ATP、O2的参与下,催化D2荧光素(D2luciferin) 氧化脱羧,产生激活态的氧化荧光素,并放出光子,产生550～580 nm 的荧光,其化学反应式如下。

这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光,其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白( GFP) 。荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光,特异性很强,灵敏度高,由于没有激发光的非特异性干扰, 信噪比也比较高。

三 荧光素酶报告基因

报告基因（report gene）是一种易于检测蛋白质或酶等表达产物的基因，可通过报告基因产物的表达来“报告”目的基因的表达调控。通常把报告基因的编码序列和基因表达调节序列融合形成嵌合基因,或与其他目的基因融合,在调控序列控制下进行表达

,

通过报告基因的表达产物来标定目的基因的表达状况。 1 常见的报告基因：

β‐半乳糖苷酶（β‐Gal）

葡萄糖醛酸酶（GUS）

绿色荧光蛋白（GFP）

分泌型碱性磷酸酶（SEAP）

荧光素酶（LUC）

2 报告基因简单实验流程

? 构建包含有报告基因的质粒

? 将构建好的质粒转染细胞

? 提供相应的刺激（诱导）

? 检测报告基因

? 数据分析

3 荧光素酶作为报告基因的优势：

? 内源性低，哺乳动物无内源性表达

? 荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响 ? 发光检测，检测方便

? 灵敏度高，10‐20摩尔荧光素酶分子

? 检测范围广，大于7个数量级

4 其它报告基因

正因为荧光素酶与底物的结合特异性很强，检出的灵敏度高，没有激发光的非特异性干扰，信噪比较高，具有其他报告基因不可替代的优势，它作为报告基因显示出良好的前景。荧光素酶已成为医学研究领域的重要工具, 在基因工程研究中被广泛作为报告基因用于单个细胞、转基因生物、动物和人体基因表达的实时、低光成像,是一种非常实用的研究方法，对于推动基因工程研究的发展具有重要作用。

四 它的检测方法

依赖生物发光特性,利用闪烁计数器( scintillationcounter) 对荧光素酶的活性作出定量检测。在标准反应条件下,加入超量底物,经一定时间内,荧光闪烁总数与样品中存在荧光素酶的活性成正比。另外,也可以采用光自显影法对荧光素酶进行定性检测。

五 利用MicroChemi检测植物叶片中的荧光素酶生物发光

1 打开MicroChemi相机开始制冷

2将植物叶片喷加发光底物（喷底物的过程需遮光）

3 将样品置入MicroChemi暗室室温孵育10min（孵育时间随样品而定）

4 打开MicroChemi软件，设置拍摄参数

5利用binning3x3，每10分钟曝光一次，共曝光三张

6添加伪彩，调节照片的对比度，得到最佳照片

附：利用MicroChemi2.0检测烟草叶片中荧光素酶的发光，曝光10min，binning3x3

 

第二篇：报告载体及报告基因总结

报告基因载体

(1)尽管可以从报告基因载体除去已知的结合位点，减少报告基因上游的转录，但从几千kb的DNA中去除所有潜在的调控序列是不可能的。因此在使用报告基因载体时，应使用合适的对照载体。报告基因质粒载体一般在大肠杆菌中繁殖，因此包括一个DNA复制起始点(ori)和基因筛选标记，通常为氨苄西林抗性基因(Ampr)。另外还具有丝状噬菌体复制起始点(flori)，可使载体形成单链DNA，便于基因突变和测序。

(2)报告基因和侧翼区：报告基因编码区和侧翼区常被改变。例如，去除SEAP（分泌型碱性磷酸酶）羧基末端24个氨基酸，使SEAP能直接分泌到细胞外，因此测定SEAP活性不必裂解细胞。去除荧光素酶的过氧化物酶体靶向序列，使荧光素酶转运到细胞质而非过氧化物酶体中。为了使报告基因表达最大化，核糖体最佳结合序列(GCCGCCCCATG)被置于报告基因的5’端。此序列能增加翻译效率，产生NcoI酶切位点，可使外源基因N末端与报告基因融合。

(3)用于插入假定的克隆启动子或增强子／启动子区；另一个位于其他位置，用于插入克隆调控元件，例如插入可远距离发挥作用的增强子。另外，还有用于插入基因筛选标记的克隆位点，用于筛选稳定表达报告基因的宿主细胞。MGS具有几个单酶切位点，用限制性内切酶催化可产生黏性末端。DNA片段可插到此位点。MCS还包括一个或两个MCS末端，此末端序列可由限制性内切酶催化断裂形成3’悬垂末端，可用核酸外切酶Ⅲ进行嵌套缺失分析。

多聚腺苷酸(polyA)可增强哺乳细胞mRNA稳定性和mRNA的翻译。polyA序列紧随报告基因之后，可指导RNA转录物3’端添加200～250个腺苷酸残基。在转录单位5’端插入polyA信号能降低源于载体的隐匿启动子序列基因表达水平，去除背景表达，增加报告基因系统的灵敏性。在报告基因转录单位上游3个阅读框中均插入终止密码子，可进一步降低源于载体的假转录背景。

常见的报告基因

报告基因必须具备的特点：①由原核基因编码的基因产物必须与同转染前真核细胞内任何相似的产物相区别；②细胞内其他基因产物不会于扰报告基因产物的检测；③报告基因编码产物的检测应该快速、简便、灵敏度高，而且重现性好。

(1)氯霉素乙酰基转移酶(CAT)

该报告基因来源于大肠杆菌转位子9，是第1个用于检测细胞内转录活性的报告基因。

氯霉素乙酰基转移酶可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉素3羟基，而使氯霉素解毒。CAT在哺乳细胞无内源性表达，性质稳定，半衰期较短，适于瞬时表达研究。可用同位素、荧光素和酶联免疫吸附测定(enzyme—linkedimmunosorbantassay，ELISA)检测其活性，也可进行蛋白质印迹(Westernblotting)和免疫组织化学分析。CAT与其他报告基因相比，线性范围较窄，灵敏性较低。

(2)β半乳糖苷酶：β半乳糖苷酶由大肠杆菌lacZ基因编码，可催化半乳糖苷水解。最大优势是易于用免疫组织化学法观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报道基因之一。以邻—硝基苯—β—D—半乳吡喃糖苷(ONPG)为底物可用标准的比色法检测酶活性，其检测动力学范围为6个数量级。氯酚红—β—D—半乳吡喃糖苷(CPRG)是另一个可用比色法检测酶活性的底物，其灵敏度比ONPG高近10倍。以MUG和荧光素二半乳糖苷(FDG)为底物则可用荧光法检测其活性。此法可检测单个细胞的酶活性，并可用于流式细胞学(FACS)分析。如以二氧杂环丁烷为底物，可用化学发光法检测酶活性，其检测动力学范围最大，灵敏度最高，与用生物发光法检测荧光素酶活性的灵敏度相似。

(3)荧光素酶：荧光素酶是能够催化不同底物氧化发光的一类酶，哺乳细胞无内源性荧光素酶。最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶。细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。萤火虫荧光素酶灵敏度高，检测线性范围宽达7～8个数量级，是最常用于哺乳细胞的报道基因，用荧光比色计即可检测酶活性，因而适用于高通量筛选。随着具有膜通透性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的应用，无需裂解细胞即可检测酶活性。Renilla荧光素酶催化肠腔素(coelenterazine)氧化，产物可透过生物膜，可能是最适用于活细胞的报告分子。将荧光素酶报告基因载体转染到细胞中，可用荧光素酶检测系统灵敏方便地测定荧光素酶基因的表达。自19xx年起，萤火虫荧光素酶基因被用作测定基因表达的报告基因，获得了广泛的应用。Promega公司的pGL3及pGL2系列载体，含SV40启动子及增强子的不同组合，有助于分析DNA片段的转录活性。

荧光素酶报告基因有许多优点：①非放射性；②比CAT及其他报告基因速度快；③比CAT灵敏100倍；④荧光素酶在哺乳细胞中的半衰期为3小时，在植物中的半衰期为3．5小时。由于半衰期短，故启动子的改变会即时导致荧光素酶活性的改变，而荧光素酶不会积累。相反，CAT在哺乳细胞中的半衰期为50小时。荧光素酶浓度在10—16mol／L(10pS／L)到10-8mol／L(1mg／L)范围内，荧光信号强度与酶浓度成正比。在理想条件下，可检测到l0-20mol／L的荧光素酶。Promega公司的荧光素酶检测系统比一般的方法灵敏及简单，产生的光稳定。

(4)分泌型碱性磷酸酶(SEAP)：SEAP是人胎盘碱性磷酸酶的突变体，无内源性表达。SEAP缺乏胎盘碱性磷酸酶羧基末端的24个氨基酸。其优点是无需裂解细胞，只用培养介质即可检测酶活性，便于进行时效反应试验。以间硝基苯磷酸盐(PNPP)为底物时可用标准的比色法测定酶活性，操作简单，反应时间短，价格廉价，但灵敏度低。以黄素腺嘌呤二核苷酸磷酸为底物进行比色测定，其灵敏度增高。SEAP可催化D—荧光素—O—磷酸盐水解生成D—荧光素，后者又可作为荧光素酶的底物，此即两步生物发光法检测酶活性的原理。此方法灵敏度高，接近于荧光素酶报告基因的检测。还可用一步化学发光法检测酶活性。

(5)荧光蛋白家族：荧光蛋白家族是从水螅纲和珊瑚类动物中发现的相对分子质量为20 000～30 000的同源蛋白。绿色荧光蛋白(GFP)是应用最多的发光蛋白。GFP存在于发光水母(AequoreaVictoria)中。用395 Bin的紫外线和475 nm的蓝光激发，GFP可在508nm处自行发射绿色荧光，无需辅助因子和底物。GFP最大的优势是无需损伤细胞即可研究细胞内事件。19xx年克隆了GFP基因，目前已获得几个突变体，如“红色迁移”突变体(red—shiftmutant)，其荧光更强。其他突变体还有蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型GFP(EGFP)和去稳定EGFP(destabilizedEGFP)等。红色荧光蛋白(RFP)是从珊瑚(Discosoma sp．)中分离的发光蛋白

(drFP583或DsRed)，可发射明亮的红色荧光。这些常用的报告基因也可被联合应用，同时检测2个甚至3个基因的表达。报告基因的选择依赖于其灵敏性、可靠性及监测的动力学范围。稳定性好的报告基因适于基因转录动力学研究和高通量筛选，尤其适用于基因转移的定性研究。