微生物学实验报告.txt人生重要的不是所站的位置，而是所朝的方向。不要用自己的需求去衡量别人的给予，否则永远是抱怨。

微 生 物 学 实 验 报 告

（格式标准）

　　

　　(生命科学专业)

　　

　　教 师：黎 勇

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　目录索引

　　

　　实验一　油镜的使用和细菌的简单染色法    3

　　实验二　细菌的革氏染色与芽孢染色    5

　　实验三　常用培养基的配制    7

　　实验四　酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别    8

　　实验五、微生物大小的测定与显微计数  10

　　实验六　环境中微生物的检测和分离纯化    11

　　实验七　细菌鉴定中常用的生理生化反应    12

　　实验八　（综合实验）化能异养微生物的分离与纯化  13

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　课程名称：　微生物学　　　　　　　实验班级：化生系生命科学本科

　　实验日期：　　　　　　　　　　　　指导教师：黎勇

实验一　油镜的使用和细菌的简单染色法

　　〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术；观察细菌的基本形态；学习观察细菌的运动性的基本方法。

　　〔基本原理〕

　　1. N·A=n·sinα 

　　2. D=λ/2N.A

　　3. 目镜可提高放大倍数，但有效放大率取决于镜口率。已经分辨的物体不放大看不清，未分辨物放得再大也看不清。

　　4. 用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时，可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。

　　〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸；细菌、放线菌等固定装片；培养18小时左右的B.subtilis.  S.arueus菌斜面培养物；无菌水、生理盐水。

　　〔方法步骤〕：

（一） 油镜的使用

镜检装片在中倍（或高倍镜）下找到目的物，并使位于视野正中　　聚光镜上升到最高位置，虹彩光圈开到最大，镜头转开成八字形　　在玻片的镜检部位（光斑处）滴一滴香柏油　　油镜转入正下方　　　侧视小心上升载物台（缩短镜头与装片距离，镜头浸入油中，至油圈不扩大为止镜头几与装片接触）　粗调器徐徐下降载物台（密切注视视野，当捕捉到物像时，立即用细调器校正）　仔细观察并绘图

取出装片，清洗油镜：擦镜纸拭去镜头上的香柏油　　擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留（用手指辅助，迅速拭擦一、二次）　　　用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯（2-3次）。

（二） 细菌的简单染色法：涂片　　干燥　　火焰固定　　染色　　水洗　　干燥　　油镜观察

（三） 细菌运动性的观察　取洁净盖玻片，四周涂上凡士林　　　滴加一小滴菌悬液　　凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上　　翻转观察

　　〔结果分析〕

　　1、画一圆圈表示视野，选取所观察的微生物绘图，注意特殊结构、形状和排列。（描绘时按视野实际大小5－10倍绘制）

　　

　　

　　

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　　　菌名：大肠杆菌　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　菌名：金黄色葡萄球菌

　　　　放大倍数：100×10（×5）　　　　　　　　　              放大倍数：100×10（×5）

　　　　特殊结构：无                                            特殊结构：无 

　　视野观察下微生物的形态

　　2、油镜使用时为什么必须干燥装片？

　　防止水油分层，光受到折射而影响油镜性能的发挥

　　〔实验讨论〕

　　首次实验中有几个要点：一是按无菌操作取用菌；二是涂片技术的掌握；三是油镜使用技术。凡实验中学生的所思所想，如无菌操作技术要点、自行处理实验材料、失败与思考等均可进行讨论（如涂片时蒸馏水不宜过多、取用菌时防止菌被灼烫变形、取菌宜少不宜多等均是可以讨论的内容）。

实验二　细菌的革氏染色与芽孢染色

　　〔目的要求〕观察细菌菌落的特征；掌握简单染色法、革兰氏染色法的原理及操作步骤；在油镜下观察细菌个体形态；学习环境中微生物的检查方法，并加深对微生物分布广泛性的认识

　　〔器材用具〕E.coli\B.subtilis\S.aureus.的斜面培养物（18－24小时）以及菌落平板各一个；染液：草酸铵结晶紫、划兰氏染液、卢戈氏碘、95%的乙醇、蕃红；无菌水、显微镜、载片、滤纸、液体石蜡是、、擦镜纸、接种环。

　　〔方法内容〕：

　　（一）实验室环境中微生物的检查

　　（二）革兰氏染色法　涂片固定　　冷却　　结晶紫染色1min　　水洗　　碘媒染1min　　95%乙醇30-60s　　水洗　　番红复染2－3min　　　水洗　　　干燥　　　油镜镜检

　　（三）芽孢染色　涂片固定　　　孔雀绿加热染色（勿干）5min　　水洗　　　番红复染1min　 

　　水洗　　　镜检

　　〔结果分析〕实验结果被染成紫色者即为革兰氏阳性，被染成红色者为革兰氏阴性；菌体染成红色，芽孢被染成绿色。

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　　　菌名：大肠杆菌　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　菌名：金黄色葡萄球菌

　　　　放大倍数：100×10（×5）　　　　　　　　　              放大倍数：100×10（×5）

　　　　染色反应：红色（阴性）                                  染色反应：紫色（阳性） 

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　菌名：枯草芽孢杆菌　　　　　　　　

　　放大倍数：100×10（×5）　　　　

　　染色反应：紫色（阳性）        

　　图1　视野观察下细菌的革兰氏染色反应

　　

　　

　　   

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　图2　枯草芽孢杆菌芽孢形态图

　　

　　〔实验讨论〕

　　严格掌握脱色程度，是成败的关键。若脱色时间过度，则阳性菌初时之紫色脱出，复染成红色，误成阴性，反之脱色时间不足，阴性菌在初染时的紫色未能脱出，复染时不能染成红色，误以为阳性菌；涂片不能厚；卢弋氏碘即用即配。

　　

　　作业

　　1、 绘出所观察到到细菌的视野图，并说明染色反应。

　　2、 哪些因素会影响到革兰氏染色结果的正确？其中是关键的一步是什么？

菌龄及培养条件和染色技术是最主要的，关键是脱色。

　　3、 怎样对未知菌进行革兰氏染色，以证明你的结果的正确？

　　与已知菌混合涂片比较。

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

实验三　常用培养基的配制

　　〔目的要求〕了解培养基的配制原理；了解培养基常规配制程序；了解培养基过程各环节的要求和注意事项。了解半合成培养基的配制原理，学习掌握肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基的配制方法。

　　〔器材用具〕等配各种培养基的组成成分，琼脂、1N NaoH溶液 1N HCl天平或台秤高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗等。药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸报纸等。

　　〔方法步骤〕

　　(一) 玻璃器皿的洗涤和包装　以小组为单位清洗、控水，按9个为一组，分别用报纸包好并放入烘箱中等待灭菌。

　　(二) 液体及固体培养基的配制过程

　　原料称量（按配方次序）　　溶解　　调节ｐH　　过滤澄清　　分装　　塞棉塞和包札　　灭菌

　　分别按教材配方配制牛肉膏蛋白胨、马铃薯液体及固体培养基。

　　(三) 培养基的分装　用玻璃漏斗，橡皮管，小玻璃管及弹簧夹制作分装装置　　选用15×150平口试管或150mL锥形瓶贴上标签　　分装（至试管高度1/4-1/3，斜面制作用1/5，半固体用1/3）

　　要求：每人制作斜面3支。其余分装至锥形瓶中。

　　(四) 棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎　分别制作试管及锥形瓶棉塞并塞好好以牛皮纸包装头部。

　　(五) 培养基的灭菌　培养基用湿热法灭菌；皿用干热法分别灭菌。

　　(六) 斜面和平板的制作（下次试验完成）

　　(七) 培养基的无菌检查（下次实验完成）

　　(八) 无菌水的制备　同时制作无菌生理盐水，置锥形瓶中备用。

　　〔结果分析〕

　　以斜面接种培养验证培养基配制效果；

　　以平板制作及接种24小时培养验证灭菌效果；

　　简述移液管包装的注意事项。

　　〔实验讨论〕

　　灭菌器的灭菌效果必须间隔一段时间，加以验证，主要方法除无菌检查外，还通过压力试纸同时灭菌来验证其压力与温度；培养基通常成批制作备用。但制作后，其贮藏时间有一定限制，一般室温条件下不超过三周；冰箱4℃条件下可贮藏半年，过期不能用。

　　作业：

　　1、 记录培养基的成分和名称

　　2、 分析所配制培养基的碳源、氮源、能源及无机盐、维生素的来源。

所配制均为天然培养基，各成分主要来自有机质，微量元素可以由自来水提供。

　　3、 什么是天然培养基？什么是半合成、合成培养基？

实验四　酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别

　　〔目的要求〕观察并掌握酵母菌霉菌的菌落特征、个体形态、生长及繁殖方式。学习酵母死活细胞的鉴别方法。

　　〔材料用具〕酿酒酵母、红酵母、假丝酵母；(酿酒酵母和红酵母菌落平板各一个。酿酒酵母豆芽汁斜面及酿酒酵母醋酸钠斜面各一支，假丝酵母加盖片培养的平板)；7.6%孔雀绿染液，0.5%蕃红染液，苏丹黑染液，二甲苯，中性红染液，碘液；目镜测微尺、镜台测微尺；载片及盖片。

　　〔方法步骤〕

　　(一) 菌落特征的观察

　　(二) 个体形态与出芽

　　(三) 子囊孢子的观察

　　(四) 酵母死活细胞的观察。

　　〔结果分析〕描述酿酒酵母霉菌的菌落形态特征；绘图酿酒酵母的菌体、出芽方式及细胞细节；

　　（一）酵母的菌落湿润，大而隆起，颜色多样，正反面颜色一致，不透明，边缘整齐；

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　　　　菌名：酿酒酵母　　　　　　　　

　　　　　放大倍数：100×10（×5）　　　　

　　　　　特殊结构：芽（出芽繁殖）

　　

　　（二）霉菌

　　菌落特征：干燥，正反面及中央与边缘不一致；大而疏松。

　　（如右图）

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　　　　菌名：青霉（Penicillium）　　　　　　　　         菌名：毛霉（Circinella）　　　　　

　　　　　放大倍数：100×10（×5）　　　　　　　        　放大倍数：100×10（×5）　　　　

　　　　　特殊结构：分生孢子梗（帚状分枝）　　　        　特殊结构：孢子囊

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　 菌名：曲霉（Aspergillus）　    菌名：根霉（Rhizopus）　

　　放大倍数：模式图　　　　　                                    放大倍数：100×10（×5）

　　特殊结构：足细胞                                              特殊结构：假根

　　

　　

　　

　　〔实验讨论〕

　　作业：

　　1、 绘图说明所观察到的酵母菌、霉菌的形态特征。

　　

　　

　　

　　

实验五、微生物大小的测定与显微计数

　　〔目的要求〕学习并掌握用测微尺测定微生物细胞大小的方法；了解血细胞计数板的构造及计数原理，掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

　　〔材料用具〕啤酒酵母；显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺；血球计数板；盖玻片，载玻片，滴管，试管，无菌水，

　　〔方法步骤〕

　　(一)酵母细胞大小测定

　　(1) 目镜测微尺的校正   (2) 细胞大小的测定

　　(二) 显微计数法

　　(1) 镜检计数室

　　(2) 菌悬液制备及加样

　　(3) 计数

　　(4) 清洗计数板

　　〔结果分析〕结果记录入表中。

　　1、目镜测微尺的标定结果（精确到零点几小格）

物镜倍数

（目镜均为10倍）

目镜测微尺的格数

（小格）

镜台测微尺的格数

（小格）

目镜测微尺的每格的长度（μm）

40倍

　　2、酵母菌大小测定结果

菌号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

目镜测微尺的格数（小格）

长轴

短轴

　　酵母大小平均值＝±（保留小数点后2位）

　　长轴＝　　　　　　　　　　　　　　　　　短轴＝

　　3、血细胞计数板对酵母菌悬液计数结果

实验次数

各中格中菌数

总菌数

稀释倍数

平均值

菌数(个/mL)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

　　〔实验讨论〕

　　

　　作业：

1. 什么更换不同放大倍数的目镜和物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺校正。

2. .    根据实验体会说明血细胞计数法的误差主要来自哪些方面？如何减少误差？

3. .    在滴加菌液时，为什么要先置盖玻片然后滴加菌液？能否先加菌液再置盖玻片？

4. .    用血球计数板测定微生物数量时，哪些步骤易造成误差？如何预防？计算细胞数目时此法是否可以适用？

实验六　环境中微生物的检测和分离纯化

〔目的要求〕

1、 学习并掌握各种无菌操作技术，并用此技术进行微生物的划线分离接种

2、 学习掌握平板菌落计数法

〔基本原理〕

土壤是微生物生活的大本营，是生物多样性的重要场所，也是发扬微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多的菌株。划线法是常用的分离与纯化方法，通过无菌操作条件下，"渐划渐稀"的效应而得到菌落纯的菌株。

平板菌落计数法是将待测样品经过适当稀释，使其中的微生物充分分散形成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品含菌量。这种方法为活菌计数法，广泛应用于生物制品及污染程度（含菌指数）的检测。

〔材料与用品〕

土样10g，无菌平皿（20套）及无菌水，牛肉膏蛋白胨平板（2只）；取液器（0.5mL及1mL各三支）；无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，记号笔，酒精灯，火柴，试管架

〔方法步骤〕

1、周围环境中微生物的检测

平板分4个区做好标记　　用未洗的手指及肥皂洗过的手指（1次、2次、3次，或其它）分别在四个区上涂抹　　　倒置到37℃培养24小时观察结果。

2、土壤中微生物分离纯化及平板计数

采土样（5－20cm）土10g，装入到已灭菌的牛皮袋（信封）中，封好袋口　　1.0g加入99mL无菌水（三角瓶）中　　　1mL无菌吸管0.5mL加入到4.5mL无菌水试管中，吹吸三次，振荡均匀(10-3)。同法得10－4－10－6土壤溶液　　　

          用接种环沾取10-2土壤悬液在已经凝固的平板表面进行划线分离

     

　　　　　分别取各浓度土壤悬液0.1mL对号均匀地放入已写好稀释度的牛肉膏蛋白胨平板，用无菌涂棒涂匀（多涂几遍）。每个浓度做3个平板。

〔结果分析〕

1、 有较大片菌苔生长时，弃用。

2、 选择平均菌落数在30－300之间的平板。只有一个浓度符合此范围时，以该平均菌落数为准；有两个浓度的平板菌落数在30－300之间时，按两者的总数平均决定，比值小于2，取平均，比值大于2则取较少的菌落总数。所有菌落数大于300，取稀释度最高的平均菌落数乘稀释倍数；所有菌落数均小于30，取稀释度最低的平均菌落数乘稀释倍数（即当所有菌落数均不在30－300之间时，此实验的精确度要求下，可以最接近30或300的菌落数乘稀释倍数）。

〔实验讨论〕

土壤中的菌数量在哪个数量级？你分离的微生物主要有哪些种类？为什么？

105数量级，主要是细菌，也有酵母。主要通过其菌落特征来判断。细菌的菌落为湿润，其正反面颜色一般一致，普遍比较小。酵母的菌落湿润，大而隆起，颜色多样，正反面颜色一致，不透明，边缘整齐；而霉菌菌落特征：干燥，正反面及中央与边缘不一致；大而疏松。

实验七　细菌鉴定中常用的生理生化反应

〔目的要求〕了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应方法；通过对不同细菌对不同含碳、氮化合物的分解利用情况，了解基代谢多样性；学习不同培养基基中的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。

〔实验原理〕各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。细菌的这种代谢方式可供鉴别细菌之用。用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称为细菌的生理生化反应。有些细菌能发酵葡萄糖，而不能分解乳糖；有些细菌能分解某种糖产生有机酸和气体；有的细菌则只产酸不产气。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫（ｐH4.4红色～ｐH6.2黄色），当发酵产酸时，培养基由紫色变黄，气体的产生则可由试管中倒置的杜氏小管中有无气泡来判断。大肠杆菌不产生丁二醇，V.P.试验为阴性。其进行混合酸发酵，故甲基红试验为阳性。产气杆菌则进行丁二醇发酵，V.P试验为阳性，甲基红试验为阴性。

〔材料用具〕E.coli ，变形杆菌，枯草芽孢杆菌，产气杆菌，粪水中分离的未知菌种斜面，糖发酵培养基；超净工作台，恒温培养箱，试管，移液管，杜氏小管。甲基红试剂、V.P. 试剂。

〔实验步骤〕各取4支相应的培养基，标记好发酵培养基的名称、所接菌种名及组号，1支接大肠杆菌，1支接变形杆菌，1支接未知斜面菌种，1支不接。

1、 糖发酵试验

2、 甲基红试验

3、 V.P.试验

接种后37℃分别培养24h、48h、48h，观察实验结果，将实验结果填入表中。

〔实验结果〕

表7－1　实验结果

编号

大肠杆菌

枯草芽孢杆菌

产气杆菌

未知菌

CK

葡萄糖发酵

乳糖发酵

甲基红实验

V.P.试验

〔实验讨论〕

如：讨论通过哪些生理生化反应可以区分大肠杆菌，产气杆菌？

大肠杆菌不产生丁二醇，V.P.试验为阴性。其进行混合酸发酵，故甲基红试验为阳性。产气杆菌则进行丁二醇发酵，V.P试验为阳性，甲基红试验为阴性。

实验八　（综合实验）化能异养微生物的分离与纯化

[目的要求]

　　    1．掌握细菌、放线菌、酵母苗和霉菌稀释分离、划线分离等技术。

　　    2．学习从样品中分离、纯化出所需菌株。

　　    3．学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。

　　    4．学习平板菌落计数法。

[基本原理]

　　土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥，偏碱性、有机质丰富的土壤中放线苗数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次实验从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌；白面曲(发面用的引子)或酒曲或果园土中分离酵母菌。

　　为了分离和确保获得某种微生物的单苗落，首先要考虑制备不同稀释度的苗悬液。各类菌的稀释度因菌源、采集样品时的季节、气温等条件而异。其次，应考虑各类微生物的不同特性，避免样品中各类微生物的相互干扰。细菌或放线苗在中性或微碱性环境较多．但细菌比放线萌生长快，分离放线菌时，一般在制备土壤稀释液时添加10%酚或在分离培养基中加相应的抗生素以抑制细菌和霉菌(如加链霉素25-50μg mL以抑制细菌；添加制霉菌素50μg／mL或多菌灵30μ／mL以抑制霉菌)；酵母苗和霉菌都喜酸性环境，一般酵母菌只能以糖为碳源，不能直接利用淀粉，酵母菌在pH 5时生长极快。而细菌生长适宜的酸碱度为pH7，所以分离酵母菌时只要选择好适宜的培养基和pH，可降低细菌增殖率，霉菌生长慢，也不干扰酵母菌分离。若分离霉菌，需降低细菌增殖率，一般培养基临用前须添加灭过菌的乳酸或链霉素。为了防止菌丝蔓延干扰菌落计数，分离霉菌时常在培养基中加入化学抑制剂。要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。四大类微生物的分离培养基、培养温度、培养时间见表所示。

[材料与用品]

　1.菌源   选定采土地点舌。铲去表土层2～3cm，取3～10cm深层土壤10g，装入已灭过菌的牛皮纸袋内．封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌种的变化。从面曲中分离酵母菌。也可用酒曲等替代。

　　2．培养基   肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基、高氏合成一号培养基、豆芽汁葡萄糖培养基(制平板和斜面，

　　3．无菌水或无菌生理盐水   配制生理盐水．分装于250mL锥形瓶中，每瓶装99mL(或95mL分离霉菌用)，每瓶内装10粒玻璃珠；分装试管，每管装约4.5-5mL(不超过试管高度的1／5)。

　　4．其他试剂与用品   无菌培养皿、无菌移液管、无菌玻璃涂棒(刮刀)、称量纸、药匙、洗耳球、10％酚溶液。

[实验步骤]

　　1．稀释分离法  平板分离菌有倾注法和涂布法两种。本次实验分离细菌、放线菌、霉菌时采用倾注法，酵母菌分离采用涂布法：

　　(1)细菌的分离    1)制备土壤稀释液    称取土样1 g，在火焰旁加入盛有99mL并装有玻璃珠的无菌水或无菌生理盐水锥形瓶中．振荡10一20min，使土样中菌体、芽孢或孢子均匀分散，制成10-2稀释度的土壤稀释液。然后按10倍稀释法进行稀释分离，以制备10-2稀释度为例，具体操作过程如下：取4.5 mL无菌水试管6支，按10-2......10-7顺序编号，放置在试管架上。取无菌移液管一支，从移液管包装纸套  中间撕口，将包装纸套分成上、下两段，去除下段包装纸套，在移液管上端管口装橡皮头，取出下段移液管纸套放置桌面，以右手拇指、食指、中指拿住移液管卜端的橡皮头，将吸液端口及移液管外部表面迅速通过火焰2～3次，杀灭撕纸套时可能污染的杂菌，切忌不要用手指去触摸移液管吸液端口及外部。左手持锥形瓶底，以右手掌及小指、无名指夹住锥形瓶上棉塞，在火焰旁拔出棉塞(棉塞夹在于上，不能乱放在桌上)，将lmL移液管的吸液端伸进振荡混匀的锥形瓶土壤悬液底部，用手指轻按橡皮头，在锥形瓶内反复吹吸二次(吹吸时注意第二次液面要高于第一次吹吸  的液面)，然后准确吸取0.5mL10-2土壤稀释液，右手将棉塞插回锥形瓶上，左手放下锥形瓶，换持一支盛有4.5mL无菌水的试管，依前法在火焰旁拔除试管帽(或棉塞)，将0.5m10-2土壤稀释液注入4.5m1无菌水试管内，制成l0-3的土壤稀 释液，将此移液管通过火焰再插入原来包装移液管的下段纸套内，以备再用。另取一只未用过的无菌移液管在试管内反复吹吸三次，然后取出移液管，并将其通过火焰再插入原来包装移液管的下段纸套内，以备再用。盖上试管帽。右手持10-3稀释液试管在左手十敲打20～30次。混匀土壤稀释液。再从纸套取出原来的移液管，插入稀释液已摇匀的试管内，再吹吸三次，然后准确吸出o.5mL 10-3的稀释液。置第二支装有4.5 m1无菌水试管，制成10-4：土壤稀释液。用同法再制成  10-5、10-6、10一7的土壤稀释液(为避免稀释过程误差，进行微生物计数时，最好每一个稀释度更换一支移液管)：最后用的移液管重新放人纸套内。待灭菌后，再洗刷或将用过的移液管放在废弃物筒中．用3%-5%来苏尔浸泡l h后再灭菌洗涤。   2)倾注法分离    取无菌培养皿6-9套，分别于培养皿底面按稀释度编号。稀释完毕后，用原来的移液管从菌液浓度最小的10-7土壤稀释液开始吸取1mL稀释液，按无菌操作技术加到和应编号的无菌培养皿内。再依同方法分别吸取1mLl0-6、10-5的土壤稀释液，各加到和应编号为10-6、10-5的无菌培养皿内。将已灭菌的肉膏蛋白胨固体培养基融化，待冷却至45-50度左右，分别倾入到已盛有I0-5、10-6、10-7土壤稀释液的无菌培养皿内。注意：温度过高易将菌烫死，且皿盖上冷凝水太多，会影响分离效果；低于45％培养基易凝固，平板易出现凝块、高低不平。倾倒培养基时注意无菌操作，要在火焰旁进行。左手拿培养皿，右手拿锥形瓶底部，左手同时用小指和手掌将棉塞拔开，灼烧瓶口．用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入培养基约12-15 mL，将培养皿在桌面上轻轻转动，使稀释的菌悬液与融化的琼脂培养基混合均匀．混匀后静置桌上，待凝。  3)培养    待平板完全冷凝后，将平扳倒置于35-37℃恒温培养箱中，培养24～48h观察结果。

　　(2)放线菌的分离

1) 制备土壤稀释液  称取土样l g，加入盛有99m1并装有玻璃珠的无菌水或无菌生理盐水锥形瓶中．并加人lo滴10％酚溶液(抑制细菌生长，可用l％的重铬酸钾溶液代替lo%酚溶液．效果更好)。振荡后静置5min，即成10-2土壤稀释液。

2) 倾注法分离    按前法将土壤稀释液分别稀释为10-3、10-4、10-5三个稀释度，然后用无菌移液管依次分别吸取lmL 10-5、l0-4、10-3土壤稀释液于对应编号的无菌培养皿内，用高氏合成1号培养基依前法倾倒平板，每个稀释度做2～3个平行培养皿。理盐水内，振荡20min，即成10-2的面曲稀释液。若选用果园上样，也依前法称取土样，制成10-2壤稀释液。  

3) 涂布法分离    依前法向无菌培养皿中倾倒已融化并冷却至45-50℃的豆芽汁葡萄糖培养基，待平板冷凝后，用无菌移液管分别吸取上述l0-6、l0-5、10-4三个稀释度苗悬液0.1mL，依次滴加于对应编号已制备好的豆芽汁葡萄糖培养基平板上。右手持无菌玻璃涂棒，左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持玻璃涂棒于培养皿平板表面将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。  

4) 培养   接种后，将平板倒置于30℃恒温培养箱中，培养2～3 d观察结果。

　　 2划线分离法   菌种被其他杂苗污染时或混合菌悬液常用划线法进行纯种分离。此法将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散成由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。平板制作方法如前所述。但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍于后方可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20mL培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法和分区划线法两种。 (1)连续划线法    连续划线法是从平板边缘一点开始，连续作波浪式划线直到平板的另一端为止，当中不需灼烧接种环上的菌。以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。将菌种点种在平板边缘一处，取出接种，烧去多余菌体。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸人平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却．然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线。划线时平板面与接种环面成30～40°的角度，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线。接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠。划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。培养皿倒置于适温的恒温培养箱内培养(以免培养过程中皿盖冷凝水滴下，冲散巳分离的菌落)。培养后在划线甲板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。    (2)分区划线法   平板分四区，故又称四分区划线法。划线时每次将平板转动60一70°划线，每换一次角度，应将接种环上的菌烧死后，再在上次划线末尾处继续划线。取菌、接种、培养方法与连  续划线法相似。分区划线法划线分离的平板分4个区，其中第四区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第四区内划线与l、2、3区线条和接触，应使4区线条与l区线条和平行，这样区与区间线条夹角最好保持120度左右。先将接种环沾取少量菌在平板1区划3～5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖．将平板转动60～70°，右手把接种环上多余苗体烧死，将烧红的接种环在子板边缘冷却，再按以上方法以1区划线的苗体为菌源，由1区向2区作第二次早行划线。第二次划线完毕，同时再把平皿转动约60一70°，同样依次在5、1区划线。划线完毕，灼烧接种环，关上皿盖，同上法培养，在划线区观察单菌落。本次实验在分离细菌的平板上选取单菌落。于肉膏蛋白胨平板上再次划线分离，使菌进一步纯化。划线接种后的平板，倒置于30℃恒温培养箱中培养24h后观察结果。

　　    3．微生物菌落计数(平板菌落计数法)  含菌样品的微生物经稀释分离培养后，每一个活苗细胞可以在平板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落。故可根据平板上菌落的数目．推算出每克含菌样品中所含的活菌总数。每克菌样品中微生物的活细胞数＝(同一稀释度的3个平板上菌落平均数X稀释倍数)/含菌样品克数。一般由三个稀释度计算出的每克含菌样品中的总活菌数和同一稀释度出现的  总活菌数均应很接近，不同稀释度平板上出现的菌落数应呈规律性地减少。如相差较大，表示操作不精确。通常以第二个稀释度的平板上出现50个左右菌落为好。也可用菌落计数器计数。

　　    4．平板菌落形态及个体形态观察    从不同平板上选择不同类型菌落用肉眼观察，区分细菌、放线菌、酵母茵和霉菌的菌落形态特征。并用接种环挑菌，看其与基质结合紧密程度。再用接种环挑取不同菌落制片，在显微镜下进行个体形态观察。记录所分离的含菌样品中明显不同的各类菌株的主要菌落特征和细胞形态。

　　    5. 分离纯化菌株转接斜面(斜面接种)  在分离细菌、放线菌，酵母苗和霉菌的不同平板上选择分离效果较好，认为已经纯化的苗落各挑选一个用接种环接种斜面。将细菌接种于肉膏蛋白胨斜面，放线菌接种于高氏1号斜面，酵母菌和霉菌接种于豆芽汁葡萄糖斜面上。贴好标签，在各自适宜的温度下培养，培养后观察是否为纯种，记录斜面培养条件及苗苔特征。置冰箱保藏。

 [实验报告]

1. 简述分离微生物纯种的原则及列出分离操作过程的关键无菌操作技术。

2. 四大类微生物的分离方法及培养条件

　

3. 分离的微生物平板菌落计数结果

4. 样品中单菌落菌株的菌落培养特征与镜检形态

5. 斜面培养条件及菌苔特征(包括纯化结果)。

　

[思考题]

1. 稀释分离时．为什么要将已融化的琼脂培养基冷却到45～50℃左右才能倾入到装有菌液的培养皿内?

2. 划线分离时为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉?划线时为何不能重叠? 1. 

3. 在恒温箱中培养微生物时为何培养皿均需倒置?

4. 分离某类微生物时培养皿中出现其他类微生物，请说明原因。应该如何进一步分离和纯化；经过-次分离的菌种是否皆为纯种，若不纯，应采用哪种分离方法最合适?

5. 根据哪些菌落特征可区分细菌、放线苗、酵母菌与霉菌?它们的细胞结构表现在菌落形态上有什么联系？

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　1