血红蛋白电泳操作规程

血红蛋白电泳操作规程

一．项目名称

血红蛋白电泳（HYDRAGEL HEMOGLOBIN）

二．检验方法名称

琼脂糖凝胶区带电泳

三．方法学原理

血红蛋白的结构、分子特性取决于形成其肽链的氨基酸顺序和性状。氨基酸不同可形成不同的血红蛋白，其表面电荷不同，在电场中的泳动率不同，这还与pH、电泳缓冲液的离子强度等有关。血红蛋白异常有二种类型：血红蛋白性质或结构的异常称之为血红蛋白病。血红蛋白中的一条链合成减少引起血红蛋白性质异常，称之为地中海贫血。实验使用洗涤过红细胞的溶血液来进行，在碱性的凝胶片上进行电泳来分离血红蛋白，分离出来的片段通过氨基黑染色剂来显色，烘干后的凝胶片就可以用来解释结果了。

四．方法学溯源

自19xx年由Tiselius发现了移界电泳（moving boundary eectrophoresis），而后，这种技术的各种局限性已逐渐被区带电泳（zone elecrrophoresis）所克服，区带电泳的条件和支持介质的选择是电泳成败的关键。

五．仪器

（一） 型号：SEBIA HYDRASYS (PN1210)

（二） 分析和计算参数：

1． 处理量：约45个样本/小时

2． 所需样本量：10ul

3． 检验时间：约半小时

4． 重复性：有良好的批内和批间重复性

5． 电泳参数：电压0－300V（可选至3000V）

电流0－500mA

功率0－100W

六．试剂及配套品

（一） 试剂

1． HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN（E）试剂盒

HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN（E）试剂盒

（1） 商标：SEBIA

（2） 包装规格：70测试/150测试

（3） 货号：PN4106/ PN4126

2． 脱色液

（1） 商标：SEBIA

（2） 包装规格：Pack for 10×100ml

（3） 货号：PN4540

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血红蛋白电泳操作规程

(4) 成分：柠檬酸

3．洗涤液

（1） 商标：SEBIA

（2） 包装规格：Pack for 10×80ml

（3） 货号：PN4541

（4） 成分：叠氮钠

4．生理盐水

（二） 配套品

血红蛋白质控

（1） 商标：SEBIA

(2) 包装规格：Pack for 1×1ml

(3) 货号：PN4791

七．操作步骤

㈠ 开机，启动电泳仪。

㈡ 将加样梳置于平板上，有数字的一端向上，在2分钟内完成每块加样梳的加样，每孔加10ul样品，然后齿梳向上把加样梳放于湿盒内5分钟。

㈢ 选择“7/15Hb”电泳程序。当预期HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E)凝胶片上出现HbF和HbS，为了更好的分离，推荐使用“7/15 Hb F-S”电泳程序。

㈣ 从包装袋内取出缓冲条，将其固定在电极支架背侧的钉上，再取出凝胶，用薄滤纸快速轻轻地吸去凝胶表面多余的液体，在温控板表面下1/3处加120μl[HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN（E）]或200ul[HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN（E）]蒸馏水或去离子水，将凝胶片底边紧靠框架底边，边缘对齐边线，略弯曲凝胶片慢慢放平，注意凝胶片下面勿出现气泡。 ㈤ 自然放下支架，从湿盒中取出加样梳并去除齿梳下的保护支架，“7/15Hb”电泳程序时，将加样梳放在4号位置，“7/15 Hb F-S”电泳程序时，将加样梳放在3号位置。注意点样梳上的数字必须面对操作者，关上电泳舱盖，按下键盘左侧的绿色箭头“START”键，电泳开始，确保仪器右侧的空气通道不被堵塞。

㈥ 电泳仪自动发出蜂鸣声,提示电泳结束，打开电泳盖，将加样梳和缓冲条丢弃，取出已烘干的胶片，用湿纸巾擦拭电极和温控板，将胶片固定于凝胶支架上放入染色空间中，在检查染色液瓶内是否有300ml染色液，脱色液瓶内是否有1000ml脱色液以及是否排空了废液瓶后，选择“PROT./B1-B2/Hb”染色程序并按“start”键开始染色。

㈦ 在染色、脱色以及干燥步骤完成后，电泳仪自动发出蜂鸣声，取出凝胶支架，将烘干的胶片用光密度仪进行扫描，若希望胶片背景更加清晰，在进行扫描前可以额外增加一个冲洗步骤，程序为“WASH ISOENZ/GEL”。

㈧ 关机，在电脑系统上对扫描结果进行分析。

八．参考范围

血红蛋白A ≥ 96.5%

血红蛋白F ? 2.0%

血红蛋白A2 ≤ 3.5%

九．临床意义

使用HYDRAGEL7/15 HEMOGLOBIN（E）试剂可初步筛查有无血红蛋白病和地中海贫血。若发现异常，应采用适当方法如酸性凝胶电泳等进一步分析测定，以确定异常。

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血红蛋白电泳操作规程

以下疾病的异常图谱特征：

HbA HbA2

α地贫 有H带/Bart’s带 ↓

β地贫 ↓ ↑ 〉3.5

〈 8

HbH病 有H带出现

血 红 蛋 白 B art胎 儿 水 肿 综 合 症 有 B a r t带出现〉80%

S/D病 有 S / D出 现

C/E病 有 C / E出 现

十．标本要求

㈠ 建议采用新鲜抗凝血标本。抗凝剂选用EDTA，柠檬酸或肝素均可，避免碘乙酸。采血应按照临床实验室检测要求进行。必要时，可储存于2-8℃，5天。

㈡ 按照试剂盒内使用说明对标本进行准备：

-在进行样品准备前混匀收集试管。

-抗凝血离心，5000rpm，5分钟。

-去除血浆。

-用10倍体积的生理盐水洗涤红细胞2次。若红细胞体积小于10μl，需特别小心。 -在将10μl的样本加到溶血液前，去除红细胞上层多余的生理盐水并震荡混匀。 -体积10μl红细胞加入130μl溶血液造成溶血。

-震荡混匀10秒钟，室温下培育5分钟即可。

注意：对于中度（10g/dl）或重度（7g/dl）贫血的病例，点样量应分别增大为15ul或20ul，其结果不受影响。

H 带的血红蛋白液的制备

-在进行样品准备前混匀收集试管。

-抗凝血离心，5000rpm，5分钟。

-去除血浆。

-用10倍体积的生理盐水洗涤红细胞2次。若红细胞体积小于10μl，需特别小心。 -在将40μl的样本加到溶血液前，去除红细胞上层多余的生理盐水并震荡混匀。 -体积40μl红细胞加入100μl溶血液造成溶血。

-震荡混匀10秒钟，室温下培育5分钟。

-离心，10000rpm，5分钟即可。

㈢ 避免使用溶血标本。

十一. 操作注意事项

㈠ 为达到最佳检测效果，同一试剂盒内的所有组分必须一并使用。

㈡ 氨基黑染液的配制必须按照试剂盒内使用说明配置，否则会降低蛋白片段的检测效果。 ㈢ 用薄滤纸吸去凝胶表面多余液体时，接触时间不能太长，应快速移去，以免凝胶脱水。 ㈣ 注意先挂缓冲条再放凝胶片，缓冲条取出时应均匀挤捏使缓冲液能分布均匀。

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第二篇：血红蛋白电泳检查(电泳法)

血红蛋白电泳检查（电泳法）

1. 原理

血红蛋白是由两对多肽链组成的复杂分子。每一条链含有血红素和络合铁原子的卜啉。所有血红蛋白的血红素部分都是相同的。所测定的血红蛋白的蛋白部分称之为珠蛋白。正常人血红蛋白多肽链包括α、β、δ和γ。血红蛋白的结构、分子特性取决于形成其肽链的氨基酸顺序和性状。氨基酸不同可形成不同的血红蛋白，其表面电荷不同，在电场中的泳动率不同。本实验在碱性（PH=8.60）条件下，以琼脂糖凝胶电泳的方法进行，对红细胞洗涤后造成溶血，电泳分离血红蛋白后以氨基黑染色。多余的染色液用酸性液体洗去。待琼脂糖凝胶板干燥后，肉眼可直接判别有无电泳条带异常。运用光密度扫描仪检测准确定量分析电泳条带异常情况。血红蛋白异常有二种类型：血红蛋白性质或结构的异常称之为血红蛋白病。血红蛋白中的一条链合成减少引起血红蛋白性质异常，称之为地中海贫血。

2. 标本采集

2.1 标本采集前病人准备：受检者应空腹。

2.2 标本种类：抗凝血

2.3 标本要求：抗凝剂选用EDTA，柠檬酸或肝素均可，避免碘乙酸。常规静脉采血1.8ml，加入含有109mmol/L枸橼酸钠溶液0.2ml的干燥。清洁试管中，充分混匀。

3. 标本储存：储存于2-8℃冰箱中，5天。

4. 标本运输：储存于2-8℃状态下的冰壶或泡沫箱密封运输。

5. 标本拒收标准：细菌污染、溶血或脂血标本不能作测定。

6. 试剂

6.1 试剂名称：血红蛋白电泳检查试剂

6.2 试剂生产厂家：法国Sebia公司

6.3 包装规格：150tests

6.4 试剂盒组成

琼脂糖凝胶 10块 溶血素 1瓶

缓冲液条带 10包×2条 薄滤纸 1×10张

氨基黑（浓缩液）1瓶×100ml 点样模具滤纸 10条×1盒

6.5 试剂储存条件及有效期：贮存于室温（15～30℃）或冰箱（2～8℃），不能冷冻。有效期两年。

7. 仪器设备

7.1 仪器名称：SEBIA电泳仪

7.2 仪器厂家：法国Sebia公司

7.3 仪器型号：HYDRASYS

8. 操作步骤

8.1 血红蛋白液制作：抗凝血离心，5000rpm，5分钟，去掉血浆，用10倍体积的生理盐水洗涤红细胞3次，若红细胞体积小于10ul，需特别小心。取10ul红细胞加入130ul溶血液造成溶血。震荡混匀10秒钟，室温下培育5分钟待测。

8.2 启动电泳仪

8.3 将加样器放在一平板上，有数字的一端向上。各加样孔加入10ul溶血的样品，2分钟内加样完毕。将加样器放入保湿盒内，齿端向上（转运时用塑料齿保护架）。等待5分钟，使样品扩散至齿端。打开电泳仪盖，抬起电极和加样器支架。

8.4 使用HYDRAGEL 15 HEMOGLOBINCE时选择仪器的“HBTOTAL”程序（位于链盘左侧）。

8.5 从包装袋内取出缓冲条，拿出末端的塑料片，将缓冲条两端塑料片固定在电极支架背侧的钉上，塑料片应紧贴支架。

8.6 取出凝胶板。将薄的滤纸轻轻吸去凝胶板表面的多余液体，然后立即丢弃滤纸。在电泳仪温度控制板表面的边线内加200ul蒸馏水或去离子水。凝胶面朝上，放置凝胶板，边缘对齐边线。略略将凝胶弯曲，然后放平，使水均匀分布在凝胶板下面而不含气泡。

8.7 降低支架，使缓冲条不接触到凝胶板。

8.8 从保温盒里取出加样器。取时拿保护框。折断加样器齿端保护框。将加样器放在4号位置。

8.9 关上电泳仪盖子，按下键盘左侧的绿色箭头“START”键，电泳开始。

8.10 凝胶染色扫描

8.10.1 打开盖子

8.10.2 取出并丢弃加样器

8.10.3 升高两个支架，握住塑料端取出并丢弃缓冲条。

8.10.4 打开凝胶托架，平放，将干燥的凝胶片放入两层间，然后关上托架。

8.10.5 将凝胶支架放入染色池

8.10.6 取出凝胶支架，打开盖子，取出干燥的凝胶片。

8.10.7 在光密度仪的570nm处或以黄色滤光片扫描测定。使用HYDRYS，DVSE或PREFERENCE光密度仪时，使A2片段的标记置于扫描板5mm的标志处。

9. 结果判断与参考范围

扫描得到的只是每种血红蛋白条带的相对浓度值。取出胶片后，首先清洁胶片的背面。判断溶血液的浓度是否合适，主要看基质带的浓度，如基质带浓度过淡，说明溶血液的浓度太淡。正常时A2浓度大约为基质带浓度的1-2倍。

半岁-成人:HbA≧94.5﹪,HbF﹤2.0％,HbA2﹤3.5％

1个月：HbA 12-40﹪,HbF 60-93％,HbA2 0.1-1.0％

6个月：HbA 86-98﹪,HbF 0.84-10.7％,HbA2 0.87-2.9％

脐带血：HbA 4-40﹪,HbF 30-96％,HbA2﹤1.0％

10. 质量控制

建议测定每一批样本时都附有一控制品或含有血红蛋白A,F,C和S的血样本。

11. 临床意义

11.1 检测β-地中海贫血

11.1.1 轻型：HbA2轻度升高，大多在4％-8％

11.1.2 中间型：HbA1A2缺如，HbF可达10％

11.1.3 重型：HbF：30％-90％，HbA多低于40％或甚至0％

11.2 检测α-地中海贫血

11.2.1 标准型α-地中海贫血：新生儿期HbBart′s可达5％-15％，几个月后消失。经煌焦油蓝温育后，少数红细胞内有H包涵体。血红蛋白电泳无异常发现。

11.2.2 血红蛋白H病：HbH在PH8.6或8.8电泳时，向阳极方向移动，泳速快于HbA;在PH6.5电泳时，仍向阳极方向移动。

11.2.3 血红蛋白Bart胎儿水肿综合症：Hb Bart′s占80％-100％，可有少量HbH。HbA、A2及F均缺如。

11.3 检测血红蛋白病：引起临床注意的异常血红蛋白有四种：S，C，E和D。

11.3.1 血红蛋白S：在碱性缓冲条件下血红蛋白S的条带位于A和A2片段之间

11.3.2 血红蛋白C：在碱性缓冲条件下血红蛋白C，E和A2的条带重叠在一起。若这一片段﹥15％，应怀疑有血红蛋白C或E的异常。

11.3.3 血红蛋白E：与血红蛋白C不同的是，E在酸性凝胶电泳中不与A2分离。

11.3.4 血红蛋白D：在碱性缓冲条件下，血红蛋白D和S的条带重叠在一起，但D在酸性凝胶电泳中不与A2分离。

12. 操作性能：灵敏度高、特异性强、操作简便，重复性好。

13. 注意事项：

13.1 试剂贮存于室温（15～30℃）或冰箱（2～8℃）内，不能冷冻。

13.2 不要应用溶血标本

13.3 若检测到异常血红蛋白，而又与常见的异常血红蛋白S,C,D或E不同，可使用其他方法（如球蛋白链电泳）检测，或求助于有关专门实验室。

13.4 HbF小于全部血红蛋白的2％-3％时，扫描检测HbF（或其它一些较少见的血红蛋白）只是半定量的，结果不十分准确。

13.5 对于中度或重度贫血的病例，点样量应增大为15ul或20ul，其结果不受影响。

13.6 电泳过程中不能打开盖子。在染色脱色以及干燥过程中，仪器的一些程序处于锁定状态。 13.7 最后染色后立即扫描测定。若欲保存，可用一保护物覆盖后置于干燥、暗处，避免受热，可保存约3个月。

[临床意义]

(1)HbA2增高是轻型β—海洋性贫血最重要的诊断依据；

(2)HbS病、β链异常的不稳定Hb病及某些巨幼细胞性贫血患者HbA2也可增高；

(3)缺铁性贫血时，HbA2常降低，可与轻型β—海洋性贫血鉴别；

(4)正常人Hb电泳后，一般只见两条区带(HbA和HbA2)，若出现新的区带，则可能为异常Hb，应进一步检查。