题    目:             专业基础实验报告                                 

学    院:          化 学 化 工 学 院           

专业:  生物工程  班级:  1201      学号:   2012060301          

学生姓名:          袁超                              

指导教师：          谢涛       张儒                               

完成日期：  2014年12月15日～20##年1月2日    

专业基础综合实验任务书

学院：    化学化工    专业：   生物工程    班级：  1201         

姓名：       袁超        

指 导 教 师：　谢涛   张儒　　　　　　

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　      　教研室主任：　　　　谢涛　　　

                                                院教学主任：       陈建芳      

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　   　　2015　　年　1　月　4　日

　　　　　　实验一.培养基中磷浓度对酿酒酵母胞内磷积累的影响

摘要：酿酒酵母胞内磷与胞内乙醇的积累受多种因素的影响，如渗透压、pH值、葡萄糖浓度、氮源浓度和磷源浓度等。本实验主要通过控制其他条件正常，研究不同磷浓度和葡萄糖浓度对其积累量的影响。以酿酒酵母为出发菌株，以种子的培养条件进行发酵，分别在适磷条件和富磷条件下进行研究。

关键词：葡萄糖浓度；胞内磷；乙醇

前言:胞内磷包括游离磷和聚合磷，无机聚磷酸盐（PolyP）最早是在酵母的异染质粒中发现的，它广泛分布于细菌、真菌、植物和动物细胞中，特别是酵母菌中含量丰富，如在S. cerevisiae中可高达细胞干重的10-20%。PolyP是一种含有几个到数百个正磷酸残基由高能磷酸键组成的线性聚合物，其聚合度及其存在的浓度随生理因子的不同而发生变化，这些生理因子包括培养基中磷酸盐浓度、碳源种类、氮源饥饿、碱性氨基酸添加、液泡液酸性化和呼吸类型等。在细胞中起着重要的作用。

1 材料和方法

1.1 菌株

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

1.2 培养基和培养条件

1.2.1 培养基

种子培养基(g/L)：葡萄糖100，尿素2，玉米浆8，自然pH值。

合成发酵培养基(g/L)：葡萄糖，尿素，KH₂PO₄，MgSO₄·7H₂O 0.5，CaCl₂ 0.1，微量元素溶液1mL/L，pH值不调。

微量元素溶液(g/L)：KI 0.2，ZnSO₄·7H₂O 0.9，Na₂S 0.3， SnCl₂ 0.1，NiCl 0.05，NaBr 0.05，MnSO₄·H₂O 2.5，CuSO₄·5H₂O 0.15，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.01，NaB₄O₇·10H₂O 0.6，(NH₄)₆Mo₂O₂₄·9H₂O 0.02，Al₂(SO₄)₃ 0.1，FeSO₄·7H₂O 5.56，Na₂·EDTA·2H₂O 7.46。

1.2.2 培养条件

种子培养：挑取新鲜的斜面种子1环接入种子培养液中，于30℃下一定转速下培养20h左右，即可用作种子液。

发酵方法：按5%的接种量将刚培养好的种子液接入预先装有50mL发酵培养液的500mL摇瓶中，按种子培养条件发酵。

1.3 分析方法

1.3.1提取

取一定量的发酵液离心，菌体用去离子水反复洗涤、离心两次，湿菌体与0.15%（活性氯浓度）的次氯酸钠溶液按1:5（w/v）的比例混合均匀，于25℃下反应45 min后离心，菌体用去离子水反复洗涤、离心两次；然后，用适量去离子水萃取两次（每次的萃取时间为2 h，且每隔30min振荡混匀一次），并于4000 r/min离心5 min，萃取液合并入50 mL容量瓶中，用去离子水定容摇匀；分别取萃取液10 mL、5 mL用于测定胞内甘油和游离磷含量。

1.3.2测定

游离磷（Pi）的测定：采用钼蓝比色法^［1］。

PolyP的测定：取一定量上述胞内萃取液，按1:5加入浓盐酸于100℃水浴锅中水解50 min，再测定总磷的含量，总磷含量减去游离磷含量即得PolyP含量。胞内甘油、胞内游离磷和胞内PolyP均表示成单位质量干菌体中所含该物质的质量，单位为mg/gDCW。

生物量的测定：取10 mL发酵液于4000 r/min下离心15 min，菌体用去离子水洗涤、离心两次，再于 80℃干燥至恒重，测得菌体干重（DCW）。

甘油的测定：采用高碘酸钠-变色酸法^［2］。

2 结果与讨论

2. 1 不同磷浓度条件下葡萄糖浓度的变化

通过控制不同的磷浓度和葡萄糖的浓度，设计平行实验，得出下图所示的图形。

图2.1

由图2.1可知，胞外葡萄糖浓度随培养时间下降:在磷含量为0.4g/l与1.0g/l时,培养基内葡萄糖消耗速率呈明显上身趋势;在磷含量为1.6g/l的条件下,葡萄糖消耗速率比较平缓.

2. 2不同磷浓度条件对游离磷得率的影响

通过控制磷的浓度和发酵时间，研究胞外磷的产量变化，结果如下图所示。

图2.2

由图2.2知,胞外游离磷浓度总体上呈下降趋势,并且在磷浓度为0.4~1.6g/l范围内,该趋势随磷浓度上升而减弱.

2. 3不同磷浓度条件下葡萄糖浓度对聚合磷得率的影响

为研究胞内聚合磷的产量，磷的浓度，设计不同的实验，结果如下图所示。

图2.3

由图2.3知,胞内聚和磷含量随发酵时间而增加,并且与培养基磷含量无关.

3结论                           

〔1〕  由以上各图可知，在适磷的条件下，产生的胞内磷比较少，所以要提高它的产量必须提高磷的浓度。在富磷条件下，对胞内的无机聚合磷和游离磷的影响是不一致的，所以在生产中对不同的要求要采用不同的磷浓度。

〔2〕  当磷含量较低时，各物质的积累量随磷浓度的变化基本相同。当磷含量较高时，各物质的变化的趋势不再一致。

〔3〕  在一定的浓度范围内，增加磷的浓度可提高胞内磷的产量，但超过一定的浓度变化不再明显，，因此对不同菌种选择不同的条件，对提高胞内磷的产量具有很大的促进作用。

实验二.不同碳源对人参发根培养的影响

摘要：利用发根农杆菌A₄菌株在人参根外植体上直接诱导产生发根。在1/2MS液体培养基上建立起发根离体培养系，经连续多代的培养，发根仍保持旺盛生长状态。PCR扩增结果表明，发根农杆菌G9质粒的rolC基因已在人参发根基因组中整合并得到表达。

关键词： 发根农杆菌,PCR,离体培养

前言: 发根农杆菌侵染双子叶植物，将其所含G9质粒的3/N)B片段整合到植物基因组 中，并表达产生发根。由于发根具有生长速度快、次生代谢产物含量高以及生化特性不易改变的特点，已成为继植物细胞培养后的又一新的生产植物有效成分的培养系统。人参是名贵中药材。人参皂苷是人参的主要有效成分，人参所表现出的药理活性主要是人参皂苷作用的结果。目前，人参皂苷主要从栽培人参中提取，由于人参生长缓慢（5年收获），且采用伐林栽参生产方式，所以生产成本高、资源破坏严重。我国在人参发根的诱导及其培养方面虽然已开展了一些研究，但仍有许多工作需要完善

1. 材料和方法1、MS培养基配制

（1） 母液的配制

①10×大量元素母液

用ddH2O溶解定容至1 L。

②10×CaCl2母液

取4.4 gCaCl2用ddH2O溶解至1 L

③100×有机母液

用ddH2O溶解至500 mL。

④肌醇母液（1mg/ml）

取100mg肌醇用ddH2O溶解，定容至100 mL

⑤200× 微量元素母液

用ddH2O溶解定容至500 mL。

⑥100×铁盐母液

用ddH2O溶解至500 mL。

（2）  1/2MS培养基配方（配制1L）

（3）液体培养基的配制

按照上表称取肌醇和蔗糖，用一定量ddH2O溶解，然后加入大量元素母液、微量元素、有机母液，最后加入铁盐，充分搅拌混匀后加ddH2O定容至1 L，调节至pH值等于6.0。培基配好后，倒入100 mL的锥型瓶中，每瓶30 mL。

（4） 固体培养基的配制

按照上表称取肌醇和蔗糖，用一定量ddH2O溶解，然后加入大量元素母液、微量元素、有机母液，再称取6 g琼脂粉加入其中，并置于微波炉中加热，待琼脂溶解，最后加入铁盐，充分搅拌混匀后定容至1 L，调节至pH值等于6.0。培基配好后，倒入100 mL的锥型瓶中，每瓶30 mL。

（5） 培养基的灭菌

分装完成后，将所有锥形瓶放入高温高压灭菌锅中进行灭菌，121℃灭菌20 min。如需配制1/2 MS培养基，只需将10×大量元素母液减半即可。

2.不同碳源设计方案

每组分别在配制好的未灭菌的1/2 MS培养基中分别加入①壳聚糖；②纤维素；③果糖；④麦芽糖⑤对照组（1/2MS培养基）注释:用等质量的碳源代替等质量的蔗糖。

实验分组（本实验为G2组--⑤）

1.2培养条件

在液体培养基中接种人参发根总长度约为15cm长，选取白色生长旺盛的发根。接种后称量总重量，于120r/min,25℃摇床连续培养

1.3 分析方法

每24小时观察发根一次，记录生长状况（是否染菌、颜色变化、长度、粗细、分支、培养基颜色等变化、总重量的变化等）。

2 .结果与讨论:

2.1培养观察:

      

1

2.2 空白试验组的重量数据

3结论:

1.   综合空白试验组与培养图片可推知水汽蒸发是引起重量下降的主要原因;

2.   由参根培养图片可以观察到接种1~4天内参根生长速度较明显,之后生长速度变缓;

3.   拍摄过程中由于忽视背景和角度的因素,图片质量受到影响;另外在摇床培养过程中因为三角瓶摆放不到位引起的对参根的机械损伤也会引起误差.

实验三.发根农杆菌中Rol基因的分子检测

摘要: 以提取的发根基因组DNA或菌落为模板,利用了RolB基因的特异性引物,应用PCR技术,扩增出了正确序列的RolB基因450 bp片段。

关键词: Rol基因、PCR扩增

前言: 发根状农杆菌是一种可以在双子叶植物上诱导发根症状的土壤菌,在体外，发状根表现为快速高度分枝生长这种现象的分子基础是发根农杆菌的根诱导(root-inducing, Ri)质粒上的转移DNA(transfer DNA,T-DNA)转移和整合到植物细胞的基因组上。RolB基因是发根农杆菌转化植物的决定因子，RolB 基因表达引起转基因植物形成大量毛状根。

PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方.PCR又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

1 材料和方法

1.1材料

发根农杆菌、PCR仪

1.2培养基和PCR检测

1.2.1 培养基

LB培养基的配制：

胰蛋白胨(tryptone)10g、酵母提取物(yeast extract)5g、氯化钠(NaCl)10g

固体培养基另加 琼脂粉 15-20g

加双蒸水至1000mL, 用5mol/L NaOH（约0.2ml）调pH至7.2，121℃灭菌30min

配制方法
　　（1）称量 分别称取所需量的胰化蛋白胨、酵母提取物和NaCl，置于烧杯中。
　　（2）溶化 加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，用玻棒搅拌，使药品全部溶化。
　　（3）调pH 用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2。
　　（4）定容 将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。
　　（5）加琼脂 加入所需量琼脂，加热融化，补足失水。
　　（6）分装、加塞、包扎。
　　（7）高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。

1.2.2发根农杆菌的PCR检测

以提取的发根基因组DNA或菌落为模板，以表1中引物扩增RolB基因，反应体系为：

Forward primer（10 μM）     0.5 µL

Reverse primer（10 μM）      0.5 µL

                       10*Taq buffer                2.5µL

dNTP                       1 µL

ddH₂O                     至25 µL

酶缓冲液                   2.5 µL

Taq                        0.5uL

菌液                       2 µL

具体见Taq酶说明书。

表1 RolB和RolC基因PCR扩增引物

1.3 PCR反应条件

PCR 扩增条件为：预变性94℃ 2 min；94℃ 30 s，57℃ 45 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 7 min。

1.4 分析方法

PCR产物电泳分析

①0.5×TBE缓冲液:Tris2.18g、硼酸1.10g、EDTA-Na² 0.14g，用蒸馏水定容至400mL。可配成5×TBE母液，使用时稀释10倍即可。

②配制1.2%琼脂糖凝胶制胶。

③点样：将处理好的标准样液和maker还有PCR扩增产物用移液枪吸取5uL按预定顺序通过缓冲液小心的添加到每个样品孔中。

④电泳：盖好电泳槽盖，接通电泳仪电源与电泳仪之间的电泳导线，设定电压为60V，电泳时间约为30min，直至溴酚蓝指示带经过浓缩胶与分离胶的分界线后，设定电压100v，电泳时间150min，直至溴酚蓝指示带接近分离胶底部，切断电源，电泳完毕。

2结果与讨论

2.  2.1实验数据处理结果

（第一组结果）

                （第二组结果）

2. 2实验结果分析

参照第二组实验结果分析，由于第一组组实验凝胶没有做好，在上图可见明显破损，其次点样的时候操作不熟悉，不准确，导致样品大多无效，除了marker条带，其他条带均已模糊，致结果不明显。反观第二组实验结果，有7个条带。有红色标记的是模板DNA，跟它在同一水平线上的条带就是从细菌里扩增出来的DNA。

3. 结论:

1.   基本可以确定以提取的发根基因组DNA或菌落为模板,利用了RolB基因的特异性引物,应用PCR技术扩增出了正确序列的RolB基因450 bp片段

2.   在配制PCR反应物时,由于各反应所需物度量单位小,操作时易产生将试剂滴到管口或试剂根本未滴入管内的情况.另外为了使试剂混合均匀便于反应,反应物配制完成后应低速离心10秒左右.

参考文献

[1] 诸葛健, 王正祥. 工业微生物实验技术手册[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 1994, 6: 220-222.

[2] 王正祥. 产甘油假丝酵母过量合成甘油的机理[D]. 无锡:无锡轻工大学, 1998, 12.

[3] 张嗣良, 储 炬. 多尺度微生物过程优化[M]. 北京: 化学工业出版社, 2003, 9.

[4] 微生物学（第二版）, 无锡轻工大学著, 中国轻工业出版社,1997.

[5] 郑双城等, 食品与发酵工业, 1992, 1:69～71.

[6] (日)微生物研究法讨论会编, 微生物学实验法, 北京:（科学出版社）,1983,200

[7] 白毓谦, 方善康, 高东等. 微生物实验技术. 济南: 山东大学出版社,1987.

化学化工学院大型综合实验评分表（Ⅱ）

注：按优（90—100分）、良（80—89分）、中（70—79分）、及格（60—69分）、不及格（60分以下）五档制评定成绩。