20##年12月

一种简便快捷提取小白鼠肝脏DNA的方法

吕梦春

中央民族大学生命与环境科学学院  北京  100081）

摘要:  主要运用了盐洗法提取小白鼠肝脏的基因组DNA, 利用分光光度计测定其OD260与OD280的吸光值,计算比率估计核酸的纯度, 并利用琼脂糖凝胶电泳观察DNA片段在凝胶中的位置, 鉴定DNA.实验结果显示，用盐析法提取的DNA纯度较高。是一种简单高效的提取动物肝脏的方法。

关键词:小白鼠;DNA提取; 琼脂糖凝胶电泳

One a simple and convenient Methods of Genome DNA Extraction of mouse

Meng-chun  Lv 

（MINZU university of china,BEIJING,100081）

Abstract：The genome DNAs of mouse were extracted with .Then the  ration of OD260 andOD280 was determined by ultraviolet spectrophotometer.The purity of the nucleic acid was calculated and the position of DNA segments in the gel was observed by agar sugar gel electrophoresisFinally, the methods was showed a simple, convenient, swift and economic method to genome DNA extraction.

Keywords: mouse; genome DNAs; agar sugar gel electrophoresis;

1.前言

  20世纪50年代初, DNA被证明是所有生物最主要的遗传物质. 随着生物化学、分子生物学和遗传学的发展以及基因工程等生物技术的创立,有关DNA的实验技术也得到了飞速发展. 无论是基因工程, 还是蛋白质工程, 首先都需要从生物体中提取基因组DNA( genomic DNA), 所以DNA的分离提取在分子生物学以及相关学科的研究中是一个非常重要的步骤, 分离得到DNA样品质量的好坏直接关系到下一步实验的成败. 而基因组DNA提取和纯化方法的灵敏度、特异性直接影响DNA的质量. 因此, 许多学者一直在努力探索各种基因组DNA的提取方法. 目前, 国内外已有多种提取DNA的方法, 如水煮法、酚抽提法、甲酰胺解聚法、盐酸胍裂解法、盐析法等. 在众多方法中,虽然有人对其进行过比较, 但究竟哪一种方法更适用于普遍意义上的DNA提取, 还未见报道. 本实验采用常用的盐洗法对小白鼠肝脏基因组DNA进行提取,是一种简便、快捷、实用的基因组DNA提取方法.

1.1实验目的

学习从生物中分离DNA（盐析法）的原理和方法；

掌握测定核酸DNA的原理和方法；

掌握核酸DNA的琼脂糖电泳的原理和方法；

1.2实验原理

1.2.1关于基因组DNA

 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。

本次试验中，主要利用不同浓度的NaCl 溶液, 将DNP和RNP从样品中抽提出来. 将抽提得到的核蛋白用SDS处理, DNA即与蛋白质分开. 可用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去, 而DNA则溶解在溶液中. 向溶液中加入适量的乙醇, DNA即析出. 为了防止DNA酶解, 提取时加入EDTA( 乙二胺四乙酸) 抑制DNase.加入了RNA酶，分解RNA。

1.2.2关于DNA纯度测定

紫外吸收是是实验室中最常用的测定DNA或RNA的方法，核酸样品的纯度可用紫外分光光度法进行测定、读出260nm与280nm的吸光度（A）即光密度（OD）值，从A260/A280的比值即可判断样品的纯度。纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯的RNA应达到2.0.样品中如含有杂蛋白及苯酚，A260/A280比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法做定量测定。对于纯的样品，只要读出260nm的A值即可算出其含量。

通常以A值为1相当于50μg/ml双螺旋DNA,或40μg/ml单链DNA（或RNA），或20μg/ml寡核苷酸计算。这个方法既快速又相当准确，而且不会浪费样品。对于不纯的核酸可以用琼脂糖凝胶电泳分理处区带后，经溴化乙锭染色在紫外灯下粗略地估计其含量。

1.2.3关于琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚苯烯酰胺低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。

我们需注意：

1）准备干净的配胶板和电泳槽

注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象

2）选择电泳方法

一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。

3）正确选择凝胶浓度

对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。

4）适合的电泳缓冲液

常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

5）电泳的合适电压和温度

电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15℃。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象

6）DNA样品的纯度和状态

注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。

7）DNA的上样

正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。TIANGEN公司DNA分子量标准每次上样6ul即可得到清晰均匀的条带。

8）Marker的选择

DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。TIANGEN公司的DNA Marker条带清晰，亮度均匀，质量稳定，是您实验的首选。需要注意的是Marker的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。如果选择λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65℃加热5min，冰上冷却后使用。从而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。

9）凝胶的染色和观察

实验室常用的核酸染色剂是溴化乙锭（EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBR Green，GelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。TIANGEN公司的GeneGreen相比则是性价比高的低毒替代染料，其灵敏度比传统EB染料高10倍以上。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。

2实验材料

2.1材料：0.2g 小白鼠的新鲜肝脏

2.2仪器：移液器（10uL，20uL，50 uL,100uL, 500uL,1000uL各一支），分析天平，剪刀，台式高速离心机，玻璃棒，恒温水浴锅，动物组织匀浆机，离心管（有盖，10mL，5mL，各五支），量筒（50mL一个），三角瓶（250mL）胶头滴管，电泳仪等

2.3试剂：

1）0.14mol/L NaCl-0.15mol/ L EDTA溶液：2.045g NaCl+9.300gEDTA二钠盐，定容到250mL,调PH到8.0；

2）25% SDS溶液：6.25g十二烷基硫酸钠+25mL25%乙醇；

3）5 mol/L NaCl 溶液：7.308gNaCl定容到25mL；

4）1.5mol/ L NaCl-0.15mol/ L柠檬酸三钠溶液：2.07g NaCl+0.853g柠檬酸三钠,定容到25mL；

5）0.015mol/ L NaCl-0.0015mol/ L柠檬酸三钠溶液：0.5 mL1.5mol/ L NaCl-0.15mol/ L柠檬酸三钠溶液,定容到50mL；

6）氯仿-异戊醇混合液：48mL氯仿+2mL异戊醇；

7）乙醇：70%, 80%,95%，无水乙醇各25mL；

8）0.5xTBE缓冲液：5.4gTris碱+2.75g硼酸+2 mL0.5 molEDTA-Na (0.372gEDTA二钠盐定容到20mL),定容到1L，调PH到8.0。

3实验方法

3.1 DNA的提取

( 1) 取0.2g动物（小白鼠）的新鲜肝脏, 用0.14mol/L NaCl- 0.15mol/ L EDTA溶液洗去血液, 剪碎, 加入1mL上述溶液, 用组织匀浆机充分研磨. 将糊状物离心15min（转速10000r/min,以下离心同）, 弃去上清液, 沉淀用上述溶液洗2-3次.

( 2) 向上述沉淀中加入250 uL的 0.14mol/L NaCl -0.15mol/L EDTA溶液, 然后滴加25uL  25%，SDS溶液, 边加边搅拌. 然后, 置65℃ 水浴保温10min( 不停搅拌) , 溶液变得粘稠并略透明, 取出冷至室温.

( 3) 加入100uL  5mol/ L NaCl 溶液, 使NaCl的最终浓度超过1mol/L, 搅拌15min, 加入等量的氯仿-异戊醇混合液, 轻缓振摇10min, 离心10min. 去掉沉淀, 向上清液中徐徐加入2-3倍95%的乙醇( 沉淀DNA) , DNA沉淀析出, 用玻璃棒慢慢搅动, 将DNA丝状物缠在玻璃棒上.

( 4) 将DNA粗制品置于225uL  0.015mol/ L NaCl-0.0015mol/ L柠檬酸三钠溶液中, 再加入25uL1.5mol/ LNaCl- 0.15mol/ L柠檬酸三钠溶液, 搅拌均匀. 加入一倍体积氯仿-异戊醇混合液, 振摇10min, 离心10min, 倾出上清液, 加入2倍体积95%的乙醇, 离心, DNA沉淀析出.

( 5) 将上步所得沉淀溶于225ul 0.015mol/ L  NaCl-0.0015mol/ L柠檬酸三钠溶液中, 然后徐徐加入2倍体积95%的乙醇, 边加边搅拌, 取出丝状DNA, 依次用70%, 80%, 95%及无水乙醇洗涤, 将其置于250uL  0.015mol/ L NaCl-0.0015mol/ L柠檬酸三钠溶液中,溶解，备用。

3.2 DNA纯度的测量

1）分光光度计预热30min；

2）取30uL的DNA待测液置于一个比色皿（编号1）中，加入2970uL的蒸馏水，混匀，向另一个比色皿（编号2）中加入等量的蒸馏水。

3）将波长设定为260nm,用编号2的蒸馏水调节吸光度值为零，测定编号2的吸光度值A

4）重复步骤3），测定编号2在280nm处的吸光度值A’。

3.3 DNA的琼脂糖凝胶电泳

1）连线：电泳仪的连接，正极（红色）---红色，负极——黑色；

2）凝胶槽的准备：采用胶布固定凝胶槽的两端，并应该使梳子的高度调到距槽底2、3mm.

3）凝胶槽的制备：首先称取0.4g的琼脂糖，加入50mL0.5X TBE缓冲液。轻轻摇晃后加热，使之沸腾，冷却再加热至沸腾，反复3次，然后在60℃左右时倒入到凝胶槽中，在实验过程中应该注意胶面的平整性，没有气泡。最后冷却之后拔去梳子。

4）加样：首先取出封胶条，并将试管号的胶板放在电泳槽中，然后加入buffer，使其高出胶面的1-3mm，最后采用进样器进行吸取样品少于15μL并加入到样品槽中。样品的排列如下表一：

表1  电泳加样示意图

5）电泳：V=100V。1-1.5h,至溴酚蓝移出2/3。

6）紫外灯下观察，拍照记录

4实验结果

本次试验中，260nm 处，A=0.031；280nm 处，A’=0.017;A/A’=1.8235,说明本次实验从小白鼠中提取的DNA纯度较高。将其电泳结果如图1-1：

                      图1-1   小白鼠肝脏DNA电泳图

由上图可知，DNA Marker条带整齐，密集，荧光强，且比较清晰，编号3、4无明显DNA条带。编号5、6、7的DNA条带与Marker位置一致，略欠整齐，荧光强，说明提取的DNA效率较高，但是有拖尾现象，说明DNA中存在杂质。

3. 分析与讨论

3.1实验得到的DNA较纯的原因。

1）原理方面：在实验过程中，利用了DNA在浓氯化钠（1—2mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小，在稀氯化钠（0.14 mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。将抽提得的核蛋白用SDS（十二烷基硫酸钠）处理，DNA或（RNA）即与蛋白质分开，可用氯仿—异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入适量乙醇，DNA即析出。为了防止DNA或（RNA）酶解，提取时加入EDTA（乙二胺四乙酸）。

2）材料方面：动物组织中的DNA较之于植物容易释放，只要用匀浆机研磨充分，就可以得到较多的含蛋白质的DNA。而植物由于有细胞壁，纤维素等物质，不容易获取。并且植物中大多有色素，会影响实验。

3）操作方面：操作严谨，互相监督，操作中污染少

3.2  编号3、4无DNA条带的原因

加样时没加上，或者量太少；

3.3 Marker没有完整条带的原因。

1）与Marker的比例有关；

2）电泳时间不够；

3.4  本次实验的经验教训。

1、提取方面：

1)小白鼠在称取之前要用0.14mol/L NaCl- 0.15mol/ L EDTA洗净血液，否则会影响DNA的纯度；研磨小白鼠肝脏时一定要充分；

2)实验中用95%的乙醇沉淀DNA时，乙醇的量一定要足够，约为样液的2-3倍。用玻璃棒将DNA丝状物时一定轻轻地要沿一个方向，否则DNA的量会减少；

3)配制的药品一定各含量要精准，在含有EDTA的溶液里要调其PH，使其PH约为8.0

2、电泳方面：

1）注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。

2）正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。

3）DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。

4）电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15℃。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象

5）在制备电泳胶时，一定要在凝胶60℃左右时倒入凝胶槽，否则会影响实验结果。

4.       结论

实验证明，盐析法提取基因组DNA步骤简洁, 耗时短, DNA提取纯化过程所需时间在4- 6h,且方法简便易行, 快速经济, 避免了常规方法中酚等因素的危害, 保证了所提DNA的完整性和纯度, 同时, 简化了实验操作步骤, 缩短了提取过程, 所需试剂少, 且不需要频繁更换Eppendorf 管, 能避免交叉污染.

致谢

衷心感谢我的老师王斌，在实验过程中细心的指导。半年来，老师带领着我们做各种生物化学的入门实验，耐心的给我们讲解每个仪器的用法，在实验出现问题时，总是领着我们自主思考解决问题的办法，以及总结这次的经验，在老师的谆谆教诲下，不仅产生了对实验极大的兴趣，而且从中我学到了许多科研思维方法以及锲而不舍的专研精神，获益良多，恩师的教诲使我受用终身，在此特向王老师致以崇高的敬意和衷心的感谢。

     此外，我还要感谢为我们实验器材奔波的刘老师和研究生学长学姐们，感谢你们实验中的陪伴和宝贵的意见；感谢我的组员们在试验中极力的配合，忘不了我们在深夜中为探讨明天的实验的热情，忘不了实验成功时我们胜利的喜悦。通过这次实验，我不仅掌握了基本的实验技术和方法，更加锻炼了与人合作的能力，所以，感谢你们我的组员，你们是最棒的！

最后，要感谢我的家人对我的鼓励和关心，你们不求回报的付出是我前进的动力！

参考文献

[1] 高丹丹, 陈燕, 王迎华, 等. 动物肉制品基因组DNA的提取和纯化[ J]. 食品科技, 2007, 32( 8): 42-44

[2]任时好，张天星，李春丽，等不同Tris-Cl 及SDS 质量浓度对小鼠DNA 提取的影响［J］河南农业大学学报，2008 ，42(2):192-195

[3]赵书平, 张俊洁, 尤  建, 等. 一种碘化钾提取外周血基因组DNA的方法[J]. 中华医学遗传学, 1999; 16(6): 395.

[4]乙引,罗在柒,柯波, 等. 几种DNA提取方法的比较[ J] .生物学通报, 2004,39(3) :55.

[5]童大跃, 伍新尧, 陆惠玲, 等. DNA提取方法的比较及改良[ J]. 中山大学学报( 医学科学版), 2003, 24( 4) :411- 412.

[6]陈冰，王富强，刘德稳 等. 简易快速从微量羊血中高质量基因组的方法[J]. 江西农业学报, 2008,20（1）：103-104

[7]肖波，李岩，屈慧歌，等. 两种动物基因组DNA提取方法的比较[J]. 烟台师范学院学：自然科学版, 2005;21(1): 56-58

[8]汪永庆，王新国，徐表祥，等. 一种动物基因组DNA提取方法的改进[J]. 动物学杂志, 2001; 36(1): 27-29