Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。

原理：转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。

其原理简述如下：

（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。

（2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。

（3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

 

第二篇：双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明

双荧光素酶报告基因检测试剂盒 产品编号

RG008 产品名称 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 包装 100次

产品简介：

? 碧云天生产的双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit)，是先以荧光素(luciferin)为底物来

检测萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)，后以coelenterazine为底物来检测海肾荧光素酶(Renilla reniformis luciferase，简称Renilla luciferase)，并且在后续加入Renilla luciferase的底物时同时加入了抑制Firefly luciferase催化luciferin发光的物质，使后续检测仅仅测定到Renilla luciferase的活性，实现双荧光素酶报告基因检测。

萤火虫荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。海肾荧光素酶可以催化coelenterazine氧化成coelenteramide，在coelenterazine氧化的过程中也会发出生物荧光。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定上述荧光素酶催化的氧化过程中释放的生物荧光。

通过荧光素酶和其底物这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在firefly luciferase的上游或其他适当的地方，构建成报告基因质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。Rinilla luciferase更多地被用作转染效率的内参，以消除细胞数量和转染效率的差异。

萤火虫荧光素酶催化luciferin发光的最强发光波长为560nm。海肾荧光素酶催化coelenterazine发光的最强发光波长为465nm。

本试剂盒可以测定100个样品。 ? ? ? ?

包装清单：

产品编号

RG008-1

RG008-2

RG008-3

RG008-4

— 产品名称 报告基因细胞裂解液 萤火虫荧光素酶检测试剂 10ml Renilla荧光素酶检测缓冲液Renilla荧光素酶检测底物0.1ml 说明书 1份 包装 60ml

保存条件：

RG008-1和RG008-3在4℃保存1个月有效，-20℃保存一年有效，-70℃可以长期保存；RG008-2和RG008-4在-20℃避光保存6个月有效，-70℃避光保存一年有效。

注意事项：

? 加入Renilla荧光素酶检测工作液后对于上一步骤中的萤火虫荧光素酶的抑制可以达到99%以上。但总会残留微量活性，因

此，宜在转染时把Renilla荧光素酶的表达量控制在其RLU读数高于萤火虫荧光素酶RLU读数的10%。Renilla荧光素酶的读数高于萤火虫荧光素酶的读数是完全可以的，通常不会有明显的负面影响。

为取得最佳测定效果，在用单管的荧光测定仪测定时，样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制在相同的时间内，例如30秒内。

由于温度对酶反应有影响，所以测定时样品和试剂均需达到室温后再进行测定。

为保证荧光素酶检测试剂的稳定性，可以采取适当分装后避光保存的方法，以避免反复冻融和长时间暴露于室温。一般来说，如果不分装使用三次(期间冻融三次)，对测定结果无明显影响。

样品和测定试剂混合后，必须等待1-2秒，再进行测定。测定时间通常为10秒，根据情况也可以测定更长或更短时间，但是同一批样品最好使用相同的测定时间。 ? ? ? ?

? 特别注意：Renilla荧光素酶检测工作液后需配制后立即使用，不可配制成工作液后长期保存。Renilla荧光素酶检测

工作液不太稳定，配制后如果不能立即使用在-20℃可以保存5-10天左右活力会有轻微下降，室温放置一天会导致活力下降5-10%或更多，4℃放置10天左右会导致活力下降10-20％或更多。

RG008-4 Renilla荧光素酶检测底物(100X) 配制在无水乙醇中。由于无水乙醇容易挥发，有时会在初次使用时发现体积明显小于0.1ml的情况，此时用无水乙醇把体积补足至0.1ml，并混匀后即可使用。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 ? ?

使用说明：

1. 裂解细胞：将报告基因细胞裂解液充分混匀，按如下方式加入报告基因细胞裂解液，充分裂解细胞。

对于贴壁细胞：吸尽细胞培养液后可以直接加入报告基因细胞裂解液；

对于悬浮细胞：离心去上清后加入报告基因细胞裂解液。充分裂解后，10,000-15,000g离心3-5分钟，取上清用于测定。注：细胞裂解后可以立即测定荧光素酶，也可以先冻存，待以后再测定。冻存样品需融解，并达到室温后再进行测定。

器皿类型 96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板

报告基因细胞裂解液 (微升/孔2. 融解萤火虫荧光素酶检测试剂和Renilla荧光素酶检测缓冲液，并达到室温。Renilla荧光素酶检测底物(100X)置于冰浴

或冰盒上备用。

3. 按照每个样品需100微升的量，取适量Renilla荧光素酶检测缓冲液，按照1:100加入Renilla荧光素酶检测底物(100X) 配

制成Renilla荧光素酶检测工作液。例如，1毫升Renilla荧光素酶检测缓冲液中加入10微升Renilla荧光素酶检测底物(100X)充分混匀后即可配制成约1毫升Renilla荧光素酶检测工作液。

4.

5. 按仪器操作说明书开启荧光测定仪，将测定间隔设为2秒，测定时间设为10秒。 每个样品测定时，取样品20-100微升(如果样品量足够，请加入100微升，但每次样品的使用量要保持一致)，加入100微升

萤火虫荧光素酶检测试剂，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU(relative light unit)。以报告基因细胞裂解液为空白对照。

在完成上述测定萤火虫荧光素酶步骤后，加入100微升Renilla荧光素酶检测工作液，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU(relative light unit)。

在以Renilla荧光素酶为内参的情况下，用萤火虫荧光素酶测定得到的RLU值除以Renilla荧光素酶测定得到的RLU值。根据得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。 6. 7.