实验原理：

1）G+菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；同时乙醇使细胞壁脱水形成一道屏障，阻止结晶紫—碘复合物从胞内渗出。G-菌的细胞壁结构疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖又均含大量脂质，易被乙醇溶解，导致细胞壁通透性增加，胞内结晶紫-碘复合物被乙醇溶解析出而脱色。

2）G+菌等电点（PI2~3）比G-菌（PI4~5）低，在相同PH条件下，G+菌所带负电荷比G-菌多，故与带电的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。

实验步骤：

一、标本的制备：

1、涂片：

　　取玻片在火焰上稍微加温，以清洁纱布擦净，放置桌上，左手握菌种管，有搜持接种环，用无菌接种环取生理盐水一滴，置于载玻片的中央，再用接种环在火焰上灭菌，待冷却后，取斜面培养的葡萄球菌或大肠杆菌少许与盐水混匀，直接取1~2环菌液作涂片即可，涂片应厚薄均匀。接种环采菌后，要通过火焰灭菌才能放下。

2、干燥：

     目的是是菌体水分慢慢蒸发，固定菌形。涂片最好在室温中自然干燥，必要是将标本面向上，小心断续在弱火高处略烘，以助水分蒸发；但切勿紧靠火焰，以致标本烤枯，不堪检视。

3、固定：

     手执玻片一端，标本面向上，在火焰外层快速地来回通过三次，共2-3秒，以玻片反面触及皮肤不觉过烫为度。冷却后，染色。目的是杀死细菌，是菌体与玻片粘附较牢以及改变对染料的通透性，因活的细菌一般不能使许多染料进入细胞。

二、染色

1、初染：

将涂片标本夹持于左手，滴加结晶紫溶液盖满涂抹面，染色1~3分钟，用流水缓缓冲洗（即将龙头打开使水缓慢流出，将玻片倾斜使水在玻片面上端沿玻片流下冲洗染液）直至无颜色流下为止。

2、媒染：

加卢戈氏染液4~5滴作用30秒到一分钟，再按上法冲洗，并将片上积水轻轻洒净。

3、脱色：

在95%酒精缸中脱色约3~5秒，拿出玻片使酒精由玻片流下，如此反复2~3次，直至流下酒精略呈淡紫色为止，现按上法以流水冲洗，并将玻片轻轻洒净。

4、复染：

用稀释石炭酸-复红（或沙黄液）复染半分钟后按上法冲洗。

5、镜检。

实验结果：G+葡萄球菌被染成紫色；G-大肠杆菌被染成红色。

实验分析：实验中有些组的大肠杆菌被染成了紫色，而实际却应该为红色，这有可能与脱色的时间过少有关，因而将其染成紫色，成为假阳性。

还有一些组将葡萄球菌染成红色，这又可能是由于脱色时间过长，冲洗的时间过短所导致的。

G⁺葡萄球菌（100*）

G⁺链球菌（100*）

G^—大肠杆菌（100*）

G^—霍乱球菌（100*0

 

第二篇：革兰染色

第一讲：细菌的革兰染色

一、学习目的：了解革兰氏染色法的原理，并熟悉操作步骤，了解细菌革兰染色的注意事项。

二、实验原理：微生物的细胞小且透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。

革兰染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine ）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，而且将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液为番红。

三．革兰染色实验所需材料

1．菌种：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌

2．器材：显微镜，载玻片，染色缸等

3．染色液：草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%沙黄染色液

四．实验步骤

1、涂片： 将培养14－16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

2、 染色：

（1）初染： 加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。

（2）媒染： 滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。

（3）脱色： 将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒，立即用水冲净酒精。

（4）复染： 用番红液染1—2分钟，水洗。

（5）镜检： 干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌于枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。

革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。

五．注意事项

1、革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因此必须严格把握脱色时间。

2、选用培养18—24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

六．思考题

1、不经复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和阴性菌？

2、当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？