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（货物运输条件鉴定书/货物危险性鉴定书）

*为必填项目，对于电子产品分子式及结构式、货物主要成分、次要成分无需填写。

 

第二篇：土壤微生物的分离及鉴定报告(吉林化工学院)

吉林化工学院化工与生物技术学院

微生物学实验报告

土壤微生物的分离、培养及鉴定

学生学号： 12130129

学生姓名： 潘洋

专业班级： 生工1201

指导教师： 许崇利、谢莹

吉 林 化 工 学 院

Jilin Institute of Chemical Technology

吉林化工学院化工与生物技术学院土壤细菌分离、培养及鉴定实验报告

土壤微生物的分离、培养及鉴定

合作者：谢雨泽、徐财广 招聘行政人员，有意电话联系186xxxxxxxx。

一、实验摘要

利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据菌落形态观察、染色鉴定以及一系列的生理生化试验的结果通过查阅《伯杰氏系统细菌学手册》对照种属特征最终判断所分离纯化的细菌所属的属。

二、实验目的

1．了解培养基的概念、种类及用途

2. 了解培养基的配制原理及其常规配制程序

3. 巩固练习显微镜使用方法 4．学习和掌握细菌、放线菌、霉菌常用培养基的配制方法。

5. 掌 握 细 菌 稀 释 分离 和 划 线 分 离 技 术，平 板 倾 注 法 和 斜 面 接 种 技 术，了 解 培 养 细 菌 的培养条件和培养时间，复习平板菌落计数法。

6．学习并掌握观察细菌、放线菌以及霉菌个体形态的基本方法。

7．初步了几种中细菌的个体形态以及与其相应的菌落形态特征。

三、实验原理

1、培养基

培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质，主要用于微生物的分离、培养、鉴定、菌种保藏等方面。自然界中微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基种类很多。不同培养基一般都应含有微生物生长繁殖所需的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。此外，为了满足微生物生长繁殖的要求，还必须控制培养基的pH值。

牛肉膏蛋白胨培养基是一种用于培养细菌的培养基，属于半合成培养基。高氏一号培养基是一种用于培养放线菌的合成培养基。马丁氏培养基用于霉菌的分离培养。

2.对土壤中微生物的分离筛选及鉴定

土壤是微生物生活的大本营，它所含有的微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。 - - 1 -

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不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多。本实验从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌。

为了分离和确保获得某种微生物的单菌落，首先要考虑制备不同稀释度的菌悬液。各类菌的稀释度因菌源、采集样品的季节、气温条件而异。其次，应考虑各类微生物的不同特性，避免样品种各类微生物相互干扰。细菌或放线菌在中性或微碱性环境较多，但细菌比放线菌生长快，分离放线菌时，一般在制备土壤稀释液时添加10％酚或在分离培养基中加相应的抗生素以抑制细菌和霉菌。

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株生物的过程成为微生物分离与纯化，常用的方法有简易的细胞挑取法和平板分离法。

本实验采用平板分离法，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化，其原包括以下两个方面：

（1）在适合于待分离微生物的生长条件（如营养、酸碱度、温度与氧等）下培养微生物，或加入某种抑制剂形成只利于待分离微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物；

（2）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，

因此可通过挑取单菌落而获得纯培养，获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等方法完成。

但是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。

因此，纯培养的确定除观察其菌落的特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。有的微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。

四、实验材料与用品

1．材料与试剂

牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、琼脂、黄豆芽、NaCl、KNO3、K2HPO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4、MgSO4?7H2O、NaOH溶液（1mol/L）。

2. 仪器

天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、pH试纸、棉花、纱布、牛皮纸、线绳、报纸、玻璃涂棒、1%重铬酸钾等。

3. 菌源

选定采土地点后，铲去表涂层2～3cm，取3～10cm深层土壤10g。

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一、肉膏蛋白胨培养基的配制

1．培养基成分

牛肉膏 0. 3g

蛋白胨 1g

NaCl 0.5g

琼脂 1.5g

水 100mL

pH 7.2~7.4

2．配制方法

（1）称量及溶化：分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于烧杯中，加入所需水量的2／3左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化，倒入上述烧杯中。

（2）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。

（3）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。

（4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2~7.4。

（5）分装、加塞、包扎。

（6）高压蒸汽灭菌20分钟。

待培养基冷却至60℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。

二、高氏一号培养基的配制

1．培养基成分

可溶性淀粉 20g

KNO3 1g

NaCl 0.5g

K2HPO4 0.5g

MgSO4 0.5g

FeSO4 0.01g

琼脂 20g

水 1000mL

pH 7.2～7.4

2．配制方法

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（1）称量及溶化：先称量可溶性淀粉，置于一小烧杯中，加入少量冷水，将淀粉调成糊状，加热，使淀粉完全融化。再分别称量KNO3、NaCl、K2HPO4、MgSO4，依次逐一加入水中溶解。

（2）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。

（3）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。

（4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/lLNaOH溶液调pH至7.2~7.4。

（5）分装、加塞、包扎。

（6）高压蒸汽灭菌20分钟。

待培养基冷却至60℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。

三、马丁氏培养基的配制

1．培养基成分

葡萄糖 10g

蛋白胨 5g

K2HPO4 1g

MgSO4?7H2O 0.5g

琼脂 16g

水 1000mL

链霉素溶液（10000U/ml） 3.3mL（临用前加入）的

2．配制方法

（1）称量：称取培养基各成分的所需量。

（2）溶化：在烧杯中加入约2/3所需水量，然后依次逐一加入并溶化培养基各成分。

（3）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。

（4）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。

（5）加塞、包扎。

（6）高压蒸汽灭菌20分钟。

（7）临用前，加热融化培养基，待冷却至60℃左右，按每1000ml培养基以无菌操作加入3.3ml的链霉素溶液，迅速混匀。

五、实验步骤

一、细菌分离

1．制备土壤稀释液

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称取土样1g，加入盛有99ml无菌水的锥形瓶中，振荡10min，使土壤中菌体、芽孢或孢子均匀分散，制成10－2稀释度的土壤稀释液。然后按10倍稀释法进行稀释分离，以制备10－7稀释度为例，具体操作过程如下：取4.5ml无菌水试管6支，按10－3……10－7顺序编号，放置在试管架上。取移液管一支，准确吸取0.5ml10－2土壤稀释液，此为10－3稀释度的土壤稀释液，依次操作，制成10－4、10－5、10－6、10－7的土壤稀释液。

2．涂布分离

用无菌移液管分别吸取上述10－7、10－6、10－5、三个稀释度菌悬液0.1ml，依次加入对应编号已经准备好的平板上。右手持无菌玻璃涂棒，左手那培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持玻璃涂棒将菌也自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。每个稀释度涂两个平板。

3．恒温培养

将平板置于30℃恒温培养箱中培养24h后观察结果。

二、放线菌分离

1．制备土壤稀释液

称取土样1g，加入盛有99ml无菌水的锥形瓶中，振荡后静置5min，即成10－2稀释度的土壤稀释液。

2．涂布分离

用无菌移液管分别吸取上述10－5、10－4、10－3、三个稀释度菌悬液0.1ml，涂平板。每个稀释度涂两个平板。

3．培养

将涂好的平板放于28℃恒温培养箱中培养5～7d后观察结果。

三、霉菌的分离

1．制备土壤稀释液

称取土样5g，加入盛有95ml无菌水的锥形瓶中，振荡后静置5min，即成10－2稀释度的土壤稀释液。

2．涂布分离

将已灭菌的培养基溶化，加入链霉素溶液，待培养基凝固后，用无菌移液管分别吸取10－4、10－3、10－2、三个稀释度菌悬液0.1mL，涂平板。每个稀释度涂两个平板。

3．培养

将涂好的平板放于28℃恒温培养箱中培养3～5d后观察结果。

四、酵母菌的分离

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1．制备土壤稀释液

称取土样1g，加入盛有99ml无菌水的锥形瓶中，振荡后静置5min，即成10－2稀释度的土壤稀释液。

2．涂布分离

用无菌移液管分别吸取上述10－4、10－3、10－2、三个稀释度菌悬液0.1ml，涂平板。每个稀释度涂两个平板。

3．培养

将涂好的平板放于30℃恒温培养箱中培养2～3d后观察结果。

六、实验结果

七、实验讨论

1、制作平板培养基的注意事项是什么？

2、在马丁氏培养基的配制中，链霉素为什么要临用前才加入？

3、在恒温培养箱中培养微生物时为什么培养皿需倒置？

4、菌落干燥与湿润的原因是什么？

参考文献

[1] 林先贵 《土壤微生物研究原理与方法》 高等教育出版社 2010-3年

[2] 陈坚，刘和，李秀芬等 《环境微生物实验技术》 20xx年

[3] 布瑞德（美） 《伯杰氏系统细菌学手册》（Bergey＇s Manual of Systemaic Bacteriology）

19xx年第八版、19xx年第9版

[4] 沈萍、陈向东 《微生物学》（第2版），高等教育出版社

[5] 西尾道德 《土壤微生物基础知识》农业科技出版社

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