实验一、水中菌落总数测定

1 菌落总数测定的目的和意义

食品微生物检验方法为食品监测必不可少的重要组成部分。

(1)它是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一。

(2)通过食品微生物检验，可以判断食品加工环境及食品卫生环境，能够对食品被细菌污染的程度做出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物和食物中毒的防治措施。

(3)食品微生物检验是以贯彻“预防为主”的卫生方针，可以有效地防止或者减少食物中毒人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治上和经济上的重要意义。

菌落总数：食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（ml）检样中形成的微生物菌落总数。

菌落总数是指在被检样品的单位重量(g)、容积(m1)或表面积(cm²)内，所含能于某种周体培养基上，在一定条件下培养后所生成的细菌集落的总数。

菌落总数主要是作为判定食品被细菌污染程度的标记，也可以应用这一方法观察食一中细菌的性质以及细菌在食品中繁殖的动态。以便对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据．

2 菌落总数测定的几项说明

2.1 菌落总数的测定。是以检样中的细菌细胞和营养琼脂混合后，每个细菌细胞都能形成一个可见的单独菌落的假定为基础的。由于检验中采用37℃于有氧条件下培养(空气中含氧约20％)，因而并不能测出每g或ml检样中实际的总活菌数，厌氧菌、微嗜氧菌和冷营菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的一些细菌也受到了限制，因此所得结果，只包括一群能在普通营养琼脂中发育、嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。

2.2 鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个，成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在营养琼脂平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因此平板上所得需氧和兼性厌氧菌菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容量或表面积内的菌落数或菌落形成单位数(colony forming units，CFU)报告之。

2.3 每种细菌都有它一定的生理特性，培养时，应用不同的营养条件及其他生理条件(如温度、培养时间、PH、需氧性质等)去满足其要求，才能分别将各种细菌都培养出来。因此，要得到较全面的细菌菌落总数，应将检样接种到几种不同的非选择性培养基上，并培养在不同条件下，如温度，氧气供应等。但国家颁发的食品卫生标准对不同食品的菌落总数的规定，都是根据用普通营养琼脂进行需氧培养所得的结果确定的，因此在食品的一般卫生学评价中并不要用几种不同的非选择性培养基培养。

3 设备和材料

除微生物试验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

3.1 恒温培养箱：36℃±1℃，30℃±1℃。

3.2 冰箱：2～5℃。

3.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。

3.4 天平：感量为0.1g。

3.5 均质器。

3.6 振荡器。

3.7 无菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）活微量移液器及吸头。

3.8 无菌锥形瓶：容量250ml，500ml。

3.9 无菌培养皿：直径90mm。

3.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。

3.11 放大镜或/和菌落计数器。

4 培养基和试剂

4.1 平板技术琼脂（PCA）培养基

成分：胰蛋白胨 5.0g，酵母浸膏 2.5g；葡萄糖 1.0g，琼脂 15.0g，蒸馏水 1000ml，pH7.0±0.2

制法：将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管或锥形瓶，121℃高压灭菌15min。

4.2 磷酸盐缓冲液

成分：磷酸二氢钾（KH₂PO₄） 34.0g，蒸馏水 500ml，pH 7.2.

制法

贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500ml蒸馏水中，用大约175ml的1 mol/L 氢氧化钠液调节pH 至7.2，用蒸馏水稀释至1000ml后贮存于冰箱。

稀释液：取贮存液1.25ml，用蒸馏水稀释至1000ml，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。

4.3 无菌生理盐水

成分：氯化钠 8.5g；蒸馏水 1000ml

制法：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。

5 检验程序

菌落总数的检验程序见下图。

25ml水样 + 225ml 稀释液，均质

↓

10倍系列稀释

↓

选择2个～3个适宜稀释度的水样匀液，各取1ml分别加入无菌培养皿内

↓

每皿中加入15ml～20ml平板计数琼脂培养基，混匀

↓

培养

↓

计数各平板菌落数

↓

计算菌落总数

↓

报告

图二十 菌落总数的检验程序

6 操作步骤

6.1.1 水样的稀释：以无菌吸管吸取25ml水样置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1：10的水样匀液。

6.1.2 用1ml无菌吸管或微量移液管吸取1：10水样匀液1ml沿管壁缓慢注于盛有9ml稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），震荡试管，使其混合均匀，制成1：100的水样匀液。

6.1.3 按6.1.2操作程序，制备10倍系列稀释水样匀液。每递增稀释一次，换用一次1ml无菌吸管或吸头。

6.1.4 根据对水样污染状况的估计，选择1～3个适宜稀释度的样品匀液（可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内做空白对照。

6.1.5 及时将15ml～20ml冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

6.2 培养

待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。

6.3 菌落计数

可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony－forming units CFU）表示。

6.3.1 选取菌落数在30CFU～300CFU之间，无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数，低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均值。
    6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数。若片状菌落不到平板的一般，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界限的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

7 结果与报告

7.1.2 若两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内，按下式计算。

式中：

N——水样中菌落数；

——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n₁——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n₂——第二稀释度（高稀释度）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

7.2 菌落总数的报告

7.2.1 菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。

7.2.2 菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。

7.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

7.2.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检验结果无效。

7.2.5 以CFU/ml为单位报告。

实验二、水中大肠菌群计数——大肠菌群MPN计数法

1 实验目的
　　1.1了解和学习水中大肠菌群的测定原理和测定意义。
　　1.2 学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。
　　2 实验原理
　　水是微生物广泛分布的天然环境。各种天然水中等含有一定数量的微生物。水中微生物的主要来历有：水中的水素性微生物(如光合藻类)、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要来历于人和动物的传染性排泄物。
　　水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着意要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水尺度规定，饮用水中大肠菌群数每一升中不跨越3个，细菌总数每一mL不跨越100个。
    所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中4个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
　　水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)暗示。在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽胞杆菌等多种细菌。这些细菌都可随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量最多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行大肠菌群的查抄。
　　水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、迅速，但不适用于杂质较多、便于阻塞滤孔的水样。
    3 定义

3.1 大肠菌群：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。

3.2 最可能数：基于泊松分布的一种间接计数方法。

4 设备和材料

除微生物试验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

4.1 恒温培养箱：36℃±1℃。

4.2 冰箱：2～5℃。

4.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。

4.4 天平：感量为0.1g。

4.5 均质器。

4.6 振荡器。

4.7 无菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）活微量移液器及吸头。

4.8 无菌锥形瓶：容量500ml。

4.9 无菌培养皿：直径90mm。

4.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。

4.11菌落计数器。

5 培养基

5.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤

成分：胰蛋白胨或胰酪胨 20.0g，氯化钠 5.0g，乳糖 5.0g，磷酸氢二钠（K₂HPO₄） 2.75g，磷酸二氢钠（KH₂PO₄） 2.75g，月桂基硫酸钠 0.1g，蒸馏水 1000ml，pH6.8±0.2。

制法：将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10ml。121℃高压灭菌15min。

5.2 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤

成分：蛋白胨 1.0g，乳糖 10.0g，牛胆粉溶液 200ml‘0.1%煌绿水溶液 13.3ml，蒸馏水 800ml，pH 7.2±0.1

制法：将蛋白胨、乳糖溶于约500ml蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200ml（将20.0g脱水牛胆粉溶于200ml蒸馏水中，调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975ml，调节Ph,再加入0.1%煌绿水溶液13.3ml，用蒸馏水补足到1000 mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121℃高压灭菌15 min。

5.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）

成分：蛋白胨 7.0 g，酵母膏 3.0 g，乳糖 10.0 g，氯化钠 5.0 g，胆盐或3号胆盐 1.5 g，中性红 0.03 g，结晶紫 0.002 g，琼脂 15 g～18 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.4±0.1。

制法：将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。煮沸2 min，将培养基冷却至45℃～50℃倾注平板。使用前临时制备，不得超过3 h。

5.4 磷酸缓冲液

成分：磷酸二氢钾（KH₂PO₄） 34.0 g，蒸馏水 500 mL，pH 7.2。

制法

贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1000 mL后贮存于冰箱。

稀释液：取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1000 mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15 min。

5.5 无菌生理盐水

成分：氯化钠 8.5 g，蒸馏水 1000 mL。

制法：称取8.5g氯化钠溶于1000 mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15 min。

5.6 无菌1 mol/L NaOH

成分：NaOH 40.0 g，蒸馏水 1000 mL。

制法：称取40 g氢氧化钠溶于1000 mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15 min。

5.7 无菌 1 mol/L HCl

成分：HCl 90 mL，蒸馏水 1000 mL。

制法：移取浓盐酸90 mL，用蒸馏水稀释至1000 mL，121℃高压灭菌15 min

6 检验程序

大肠杆菌MPN计数的检验程序见左图。

7 操作步骤

7.1 样品的稀释

7.1.1 以无菌吸管吸取 25 mL 水样置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。

7.1.2 样品匀液的 pH 值应在 6.5～7.5 之间，必要时分别用 1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。

7.1.3 用 1 mL无菌吸1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓缓注入 9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。   

7.1.4 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支 1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 min。

7.2 初发酵试验

每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），36℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。

7.3 复发酵试验

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。

7.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告

按7.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表，报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。

 

第二篇：微生物观察实验报告

实验题目: 湖塘水体和沉积物中微生物的观察

姓    名：                学    号：           

班    级：                组    别：

指导教师：

实验（1）湖塘水体和沉积物中微生物的观察和计数

1.实验概述

1.1实验目的及要求

水体和沉积物是水生生物繁衍生息的基本场所。本实验通过实地调查和实验室观察实验，对湖塘水体和沉积物中微生物观察和定性，初步了解湖塘水体和沉积物中微生物的种类和分类；了解其对水体净化的正面和负面的影响。

1.2实验原理

（1）显微镜的原理

  （2）血球计数板的结构和计算方法。

   血球计数板是一块比较厚的特制玻片。玻片中央刻有4条槽，中央两条槽之间的平面比其他平面略低，中央有一个小槽，槽两边的平面上刻有9个大方格，中间的一个大方格为计数室，其长和宽均为1mm，深度0.1mm，体积0.1m³。计数室的规格是把大方格分成16个中方格，每一个中方格有分成25个小方格，总共有400个小格。

   血球计数板的计算方法是：先求得每个中方格中微生物的平均值，乘以中格数，即为一个大格中的总微生物数，再乘以10000，即为稀释后的溶液中的总微生物数。如要换成原液中的微生物总数，乘以稀释倍数即可。

   为简化计，通常取4个角上的4个中格进行计数，取其平均值，作为每个中格中微生物的平均值。

   计算公式：微生物数（mL）=（100个小格内的微生物数/100）*400*10000*稀释倍数

2.实验内容

2.1实验方案设计

选择一个池塘，对湖塘和水体和沉积物采样，观察其中微生物并计数。要求手绘观察图像，计算微生物数量。

2.1.1实验设备和材料

   （1）实验设备

       显微镜、血球计数板、载玻片、盖玻片、滴管、移液管

   （2）实验材料

       校园池塘的水体和沉积物

2.2实验过程（实验步骤、记录、数据、分析 ）

（1）用压滴法制作表本片

       取一块洁净的载玻片置于实验平台上，用滴管吸取湖水或含有沉积物的混合液，滴加在载玻片中央，用干净的盖玻片覆盖在滴液上，不要有气泡，即制成标本片。

   （2）用显微镜观察标本片上的微生物。

   （3）加被测样品到血球计数板

   取干净的血球计数板，用盖玻片盖住计数室，用细口滴管吸取少量已经充分摇匀的湖水和沉积物的混合液，滴于盖玻片边缘，微生物自行深入计数室，静止5-10min，待微生物自然沉降稳定后计数。

   （4）计数

   先用低倍镜寻找大方格网的位置（视野不要太亮），找到计数格后，换用40倍物镜观察计数。

2.3结论

手绘观察到的微生物的形状，相对大小(见附图)

   计算样品微生物数量

2.4 建议（如果有）

实验（2）湖塘水体和沉积物中微生物的革兰氏染色和定性

1.实验概述

1.1实验目的及要求

水体和沉积物是水生生物繁衍生息的基本场所。本实验通过实地调查和实验室观察实验，对湖塘水体和沉积物中微生物观察和定性，初步了解湖塘水体和沉积物中微生物的种类和分类；了解其对水体净化的正面和负面的影响。

1.2实验原理

微生物细胞由蛋白质、核酸等两性电解质及其它成分组成，表现出两性电解质的性质。细菌的等电点pI在2-5之间，所以当pH>5时，细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合而被染色。微生物体内的不同结构和染料的结合能力不同，故可用不同染料对微生物的不同结构分别染色。

2.实验内容

2.1实验方案设计

对池塘水体和沉积物中得细菌进行革兰氏染色和定性，进行微生物形态图的绘制。

2.1.1实验设备和材料

（1）       实验设备

显微镜、接种环、载玻片、酒精灯。

（2）    试剂

草酸铵结晶紫染液、革兰氏碘液、95%乙醇、番红

（3）    实验材料

校园池塘的水体和沉积物

2.2实验过程（实验步骤、记录、数据、分析 ）

（1）涂片

取干净的载玻片于实验台上，在正面边角作记号，滴一滴无菌蒸馏水在玻片中央，灼烧接种环，冷却后取样品，与玻片上水滴混匀，在玻片上涂布成一层均匀的薄层，涂布面不宜过大。

（2）固定

即干燥，干燥过程最好在空气中晾干。为加速干燥，可在微小火焰上烘干，烘干后在火焰上方快速通过3-4次，使菌体完全固定在载玻片上。不宜长时间高温烘烤，易致急速失水使菌体变形。

（3）初染

滴加草酸铵结晶紫染色液染色1-2min，水洗。

（4）媒染

滴加革兰氏碘液，染1-2min，水洗。

（5）脱色

滴加95%乙醇，洗约45s，接着水洗。或滴加95%乙醇，将玻片摇晃几次即倾倒乙醇，如此重复2-3次后水洗。

（6）复染

滴加番红，染2-3min，水洗并干燥。

（7）镜检

显微镜观察。

2.3结论

观察颜色，并判断是G（紫色）还是G（红色）。手绘观察到的微生物图像，标明颜色。

2.3.1注意事项：

（1）涂片所用载玻片要洁净无油渍。

（2）细菌不宜多，涂片不宜厚，宜薄而均匀。

（3）染色过程中勿使染色液干涸。用水洗后，应该甩去玻片上残水以免染色液被稀释而影响染色效果。

（4）革兰氏染色成败的关键是脱色时间是否合适。如脱色过度，G易被误认为G。而脱色时间过短，G易被误认为G。脱色时间长短还受涂片厚薄，脱色时玻片晃动程度影响。

2.4 建议（如果有）

2.      思考题

（1）涂片为何要固定？固定时要注意什么？

答：原因有三1、固定细菌，防止冲掉2、变形蛋白易染色3、杀死细菌，防止感染。实验中固定是用酒精灯烘干水样，应注意控制温度，控制时间，防止将菌体烧成灰烬，无法染色。固定时用载玻片背面靠近火源，而不是直接烘载玻片正面。

（2） 革兰氏染色如果只做1-4步，不用番红复染，能否分辨革兰氏染色结果？为什么？

答：能。在酒精脱色后，不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋），被酒精脱色为革兰氏阴性菌。最后一步用番红染液复染，是为了让结果更清楚。

（3）革兰氏染色在微生物学中有何实践意义？

指导教师评语及成绩：

成绩：             指导教师签名

                  

                    批阅日期