一、液-固色谱原理

液-固色谱是基于吸附和溶解性质的分离技术，柱色谱属于液-固吸附色谱。

当混合物溶液加在固定相上，固体表面借各种分子间力（包括范德华力和氢键）作用于混合物中各组分，以不同的作用强度被吸附在固体表面。

由于吸附剂对各组分的吸附能力不同，当流动相流过固体表面时，混合物各组分在液-固两相间分配。吸附牢固的组分在流动相分配少，吸附弱的组分在流动相分配多。流动相流过时各组分会以不同的速率向下移动，吸附弱的组分以较快的速率向下移动。随着流动相的移动，在新接触的固定相表面上又依这种吸附-溶解过程进行新的分配，新鲜流动相流过已趋平衡的固定相表面时也重复这一过程，结果是吸附弱的组分随着流动相移动在前面，吸附强的组分移动在后面，吸附特别强的组分甚至会不随流动相移动，各种化合物在色谱柱中形成带状分布，实现混合物的分离。

二、柱色谱分离条件

（1） 固定相选择

柱色谱使用的固定相材料又称吸附剂。

吸附剂对有机物的吸附作用有多种形式。以氧化铝作为固定相时，非极性或弱极性有机物只有范德华力与固定相作用，吸附较弱；极性有机物同固定相之间可能有偶极力或氢键作用，有时还有成盐作用。这些作用的强度依次为：

成盐作用> 配位作用> 氢键作用> 偶极作用> 范德华力作用。有机物的极性越强，在氧化铝上的吸附越强。

常用吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭等（表1）。

 

色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。酸性氧化铝pH约为4～4.5，用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质；中性氧化铝pH值为7.5，用于分离中性物质，应用最广；碱性氧化铝pH为9～10，用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物等。

吸附剂的活性与其含水量有关。含水量越低，活性越高。脱水的中性氧化铝称为活性氧化铝。

硅胶是中性的吸附剂，可用于分离各种有机物，是应用最为广泛的固定相材料之一。

活性炭常用于分离极性较弱或非极性有机物。

吸附剂的粒度越小，比表面越大，分离效果越明显，但流动相流过越慢，有时会产生分离带的在重叠，适得其反。

（2）流动相选择

色谱分离使用的流动相又称展开剂。

展开剂对于选定了固定相的色谱分离有重要的影响。 

在色谱分离过程中混合物中各组分在吸附剂和展开剂之间发生吸附-溶解分配，强极性展开剂对极性大的有机物溶解的多，弱极性或非极性展开剂对极性小的有机物溶解的多，随展开剂的流过不同极性的有机物以不同的次序形成分离带。

在氧化铝柱中，选择适当极性的展开剂能使各种有机物按先弱后强的极性顺序形成分离带，流出色谱柱。

当一种溶剂不能实现很好的分离时，选择使用不同极性的溶剂分级洗脱。如一种溶剂作为展开剂只洗脱了混合物中一种化合物，对其它组分不能展开洗脱，需换一种极性更大的溶剂进行第二次洗脱。这样分次用不同的展开剂可以将各组分分离。

三、柱色谱分离操作

（1）柱色谱装置

柱色谱装置包括色谱柱、滴液漏斗、接受瓶。

色谱柱有玻璃制的和有机玻璃制的，后者只用于水做展开剂的场合。 色谱柱下端配有旋塞，色谱柱的长径比应不小于7～8:1。

（2）分离操作

① 装柱：

色谱柱的装填有干装和湿装两种方法。

干装时，先在柱底塞上少许玻璃纤维，再加入一些细粒石英砂，然后将准备好的吸附剂用漏斗慢慢加入干燥的色谱柱中，边加入边敲击柱身，务必使吸附剂装填均匀，不能有空隙。吸附剂用量应是被分离混合物量的30～40倍，必要时可多达100倍。加够以后，在吸附剂上覆盖少许石英砂。

湿装时，将准备好的吸附剂用适量展开剂调成可流动的糊，如干装时一样准备好色谱柱，将吸附剂糊小心地慢慢加入柱中，加入时不停敲击柱身，务必使吸附剂装填均匀，不能有气泡和裂隙，还必须使吸附剂始终被展开剂覆盖。

② 洗柱：

干柱在使用前要洗柱，目的是排除吸附剂间隙中的空气，使吸附剂填充密实。洗柱时从柱顶由滴液漏斗加入所选的展开剂，适当放开柱下端的旋塞。加入时先快加，再放慢滴加速度，使吸附剂始终被展开剂覆盖。洗柱时也要轻敲柱身，排出气泡。

③ 装样和洗脱：

将待分离的混合物用最小量展开剂溶解，小心加入柱中。待混合物溶液液面接近吸附剂上的石英砂时，旋开滴液漏斗旋塞，滴加展开剂。滴加速度以1～2滴/秒为适度。整个过程中，应使展开剂始终覆盖吸附剂。

1.吸附柱色谱

色谱管为内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管，下端用棉花或玻璃纤维塞住，管内装入吸附剂。吸附剂的颗粒应尽可能保持大小均匀，以保证良好的分离效果。除另有规定外，通常多采用直径为0.07～0.15mm的颗粒。色谱柱的大小，吸附剂的品种和用量，以及洗脱时的流速，均按各品种项下的规定。

(1) 吸附剂的填装

①干法

将吸附剂一次加入色谱管，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入洗脱剂；或在色谱管下端出口处联接活塞，加入适量的洗脱剂，旋开活塞使洗脱剂缓缓滴出，然后自管顶缓缓加入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附层。操作过程中应保持有充分的洗脱剂留在吸附层的上面。

②湿法

将吸附剂与洗脱剂混合，搅拌除去空气泡，徐徐倾入色谱管中，然后加入洗脱剂将附着管壁的吸附剂洗下，使色谱柱面平整。俟填装吸附剂所用洗脱剂从色谱柱自然流下，液面和柱表面相平时，即加供试品溶液。

(2) 供试品的加入

除另有规定外，将供试品溶于开始洗脱时使用的洗脱剂中，再沿色谱管壁缓缓加入，注意勿使吸附剂翻起。或将供试品溶于适当的溶剂中，与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发去尽使呈松散状，加在已制备好的色谱柱上面。如供试品在常用溶剂中不溶，可将供试品与适量的吸附剂在乳钵中研磨混匀后加入。

(3) 洗脱

除另有规定外，通常按洗脱剂洗脱能力大小递增变换洗脱剂的品种和比例，分别分部收集流出液，至流出液中所含成分显著减少或不再含有时，再改变洗脱剂的品种和比例。操作过程中应保持有充分的洗脱剂留在吸附层的上面。

2.分配柱色谱

方法和吸附柱色谱基本一致。装柱前，先将载体和固定液混合，然后分次移入色谱管中并用带有平面的玻棒压紧；供试品可溶于固定液，混以少量载体，加在预制好的色谱柱上端。

洗脱剂需先加固定液混合使之饱和，以避免洗脱过程中两相分配的改变。

 

第二篇：实验四 柱色谱

实验五   柱色谱

计划学时：3学时

一、实验目的：学习柱色谱的操作方法。

二、实验原理：

柱色谱（柱上层析）常用的有吸附色谱和分配色谱两类。吸附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相；而分配色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂，以吸收较大量的液体作固定相，而支持剂本身不起分离作用。

吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。当待分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，于是形成了不同层次，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带，再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集；或将柱吸干，挤出后按色带分割开，再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。

 1、吸附剂

常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。吸附剂一般要经过纯化和活性处理，颗粒大小应当均匀。对于吸附剂而言，粒度愈小表面积愈大，吸附能力就愈高，但颗粒愈小时，溶剂的流速就太慢，因此应根据实际分离需要而定。供柱色谱使用的氧化铝有酸性、中性、碱性三种，本实验选择中性氧化铝。

2、溶质的结构与吸附能力的关系

化合物的吸附性与它们的极性成正比，化合物分子中含有极性较大的基团时，吸附性也较强。各种化合物对氧化铝的吸附性按以下次序递减：

酸和碱> 醇、胺、硫醇> 酯、醛、酮> 芳香族化合物> 卤代物、醚>烯> 饱和烃

3、溶剂

溶剂的选择是重要的一环，通常根据被分离物中各化合物的极性、溶解度和吸附剂的活性等来考虑。

先将要分离的样品溶于一定体积的溶剂中，选用的溶剂极性要低，体积要小。如有的样品在极性低的溶剂中溶解度很小，则可加入少量极性较大的溶剂，使溶液体积不致太大。

色层的展开首先使用极性较小的溶剂，使最容易脱附的组分分离。然后加入不同比例的极性溶剂配成的洗脱剂，将极性较大的化合物自色谱柱中洗脱下来。常用洗脱剂的极性按如下次序递增：

己烷和石油醚 < 环己烷 < 四氯化碳 < 三氯乙烯 < 二硫化碳 < 甲苯 < 苯 < 二氯甲烷 < 氯仿 < 乙醚 < 乙酸乙酯 < 丙酮 < 丙醇 < 乙醇 < 甲醇 < 水 < 吡啶 < 乙酸

所用溶剂必须纯粹和干燥，否则会影响吸附剂的活性和分离效果。

4、吸附剂色谱的分离效果不仅依赖于吸附剂和洗脱剂的选择，而且与制成的色谱柱有关：

（1）柱中的吸附剂用量为被分离样品量的30—40倍，若需要可增至100倍；

（2）柱高和直径之比一般是10:1-20:1；

（3）装柱有湿法和干法两种，本实验采用湿法装柱，无论采用哪种方法装柱，都不用使吸附剂有裂缝或气泡。

三、实验装置

 

四、实验药品

吸附剂：中性氧化铝

样品：甲基橙与亚甲基蓝的混合物

溶剂：95%的乙醇

洗脱剂：95%的乙醇；水

五、实验操作步骤：

1、装柱（湿法）

关闭活塞，向柱中倒入95%乙醇溶剂至约为柱高的1/4处，再将一定量的95%乙醇和硅胶在烧杯内调成浆状，慢慢倒入管中，将管子下端活塞打开，使溶剂流出，控制流出速度为1-2滴/s，硅胶渐渐下沉，进行均匀填料。橡皮塞轻轻敲打色谱柱下部，使填装紧密，当装柱至3/4时，再在上面加一片小圆滤纸。操作时一直保持上述流速注意不能使液面低于氧化铝的上层。

2、加样品

当溶剂液面刚好流至石英砂面时，立即沿柱壁加入2ml 95%乙醇溶液（内含1mg甲基橙和5mg亚甲基蓝），当此溶液流至接近石英砂面时，加入95%乙醇洗脱。

3、洗脱

用95%乙醇溶液洗脱，控制流出速度如前。整个过程都应有洗脱剂覆盖吸附剂。

亚甲基蓝因极性小首先向下移动，极性较大的甲基橙则留在柱的上端，形成不同的色带。当最先下行的色带快流出时，更换另一接受瓶，继续洗脱，至滴出液近无色为止。换水作为洗脱剂，这时甲基橙向柱子下部移动，用另一接受瓶收集。

六、实验关键步骤：

1、装柱要紧密，要求无断层、无缝隙，无气泡。

2、在装柱、洗脱过程中，始终保持有溶剂覆盖吸附剂。一个色带与另一色带的洗脱液的接受不要交叉。

七、思考题

1、为什么极性大的组分要用极性较大的溶剂洗脱？

2、柱子中若有气泡或装填不均匀，将给分离造成什么样的结果？如何避免？

八、习题：

1、实验报告

2、思考题

预习： 薄层色谱