纸层析法——氨基酸的分离与鉴定

一、       实验目的

1、  了解纸层析法的使用原理。

2、掌握用纸层析法分离蛋白质的操作步骤。    

二、        实验原理

1、  纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析方法，滤纸上的纤维具有羟基，是亲水基团，滤纸吸附水作为固定相，其上流经的有机溶剂即展层剂作为流动相。当展层剂流经固定相时，固定相上的样品由于亲水、疏水能力不同，在两相之间不断分配，疏水能力强的多溶于流动相，随流动相移动距离较远，亲水能力强的移动距离则较近。

2、  所有的氨基酸的α碳上均连接一个氢原子和两个亲水基团羧基（—COOH）与氨基（—NH₂），唯一的不同则在于R基团。因此R基团在氨基酸的亲水疏水能力对比中起到了决定性的作用。本实验采用丙氨酸，苯丙氨酸，天冬氨酸，其R基团分别是—CH₃，—CH₂—C₆H₅，—CH₂—COOH，其亲水疏水能力迥异，能在滤纸上明显分开。

3、  Rf值表示原点中心至显色斑点中心的距离与原点中心至流动相前沿的距离比。在一定条件下，Rf值为定值，其影响的因素有物质本身的性质，溶剂的性质，PH值，温度，滤纸的性质等等，本实验不予探究。在测量原点中心至显色斑点中心的距离时，由于斑点的形状不规范（近似圆形），所以，一般取斑点的重心，测量出重心与起点的距离即可。

 

4、  显色原理：茚三酮在弱碱性溶液中与α—氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氧，脱羧反应，最后茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮发生作用生成紫色物质。

三、        试剂

（一）提前配制试剂

8*10^-3mol/L丙氨酸溶液：精确称取0.356g晶体，溶解后定容到500ml。

8*10^-3mol/L苯丙氨酸溶液：精确称取0.661g晶体，溶解后定容到500ml。

8*10^-3mol/L天冬氨酸溶液：精确称取0.532g晶体，溶解后定容到500ml。（将上述三种溶液装于小瓶中实验时，每两组共用一组试剂）

正丁醇

88%甲酸

蒸馏水

茚三酮晶体

注：实验时，以上试剂均为每两组同学共用一组试剂。

（二）当堂配制试剂

 丙氨酸，苯丙氨酸，天冬氨酸的混合液:将上述溶液等体积混合即可

四、        实验仪器

每组：

钟罩：1                          试管：15mm*10cm *5

试管架：1                        培养皿：95mm*1

移液管：10ml *1                   洗耳球：1    

小烧杯：25ml *2  （可以用其他小规格的烧杯如20,10,8ml的代替）100ml*1

滤纸：15cm*15cm *1              

铅笔 ：1                         直尺：1

毛细吸管：4                      保鲜膜：1

细玻璃棒：1

公用：

    电吹风：3                               酒精灯：3

    订书机：3                               电子天平或分析天平：3

    称量纸：若干                            烘箱：1

    量筒：100ml*1                       薄膜手套：若干

五、        操作步骤

   （一）展层剂和平衡溶剂的配制

          1．在100ml烧杯中按照体积比 正丁醇：88%甲酸：蒸馏水=15：3：2的比例配制展层剂，建议为45ml：9ml：6ml。

          2．称取0.05g茚三酮晶体，并用玻璃棒搅拌溶于展层剂中，盖上培养皿。

          3．平衡溶剂与展层剂相同。

     （二）点样

1．实验台上铺好保鲜膜，保鲜膜下面可以蘸少量水，使得保鲜膜能与实验台面紧密贴合，此后所有操作都在保鲜膜上进行，不再赘述。

2．在距平行于15cm长的边2cm处用铅笔轻轻描出一条直线，此为展层起点线，在直线中间每隔3cm用铅笔轻轻点一个点，共点四个点。再在另一边，距边缘1cm处用铅笔轻描出一条直线，此为展层终点线。

      3．将毛细管的一端在酒精灯外焰上灼烧3~6s，毛细管管口变细即可。

          4．用毛细管分别蘸取三个氨基酸标准液和氨基酸混合液，点样于展层起点线的四个点上。点完一次后，用电吹风冷风吹干，再点第二次样。每次点样均要求斑点半径     。

       5．在标准样下面用铅笔做好标记，记录该点的氨基酸名称。

（三）平衡及展层

          1．将点好样的滤纸两侧边缘对齐但不接触，卷成筒形，并用订书机订3~4次，将圆筒固定。

          2．将圆筒竖直放入培养皿中，滤纸勿与皿壁接触，皿周围放2个25ml小烧杯，内盛平衡溶液10ml左右，盖上钟罩，平衡半个小时。

          3．用移液管吸取10ml展层剂，打开钟罩上的塞子，将移液管下端尽量伸进培养皿底部，将展层剂加入到培养皿中，拿出移液管。添加30ml展层剂，塞上钟罩塞子。

          4.展层约两个半小时，当溶剂前沿至展层终点线时，取出滤纸。

    （四）显色及R_f值计算

          1．将取出的滤纸用电吹风冷风吹干，并放入65℃左右的烘箱中烘10min。

          2．取出烘完的滤纸，估计出斑点的重心，共六个点（三个标准液，三个由混合液分离出），并用铅笔轻轻点出。

          3．展层剂跑的距离d₀=12cm，用直尺测量出斑点中心到展层起点线的距离d₁~d₆，计算R_fx=（x=1，2…6）

4．将混合样分离出的斑点的R_f值与标准样的进行对比，从而认清各斑点的氨基酸种类，并在滤纸上标明。

       

六、        注意事项

1.       实验全程戴一次性薄膜手套，全套实验在铺在实验台上的薄膜上进行。原因：人的皮肤上含有含氮化合物，而实验台上可能未洗干净残留其他氨基酸，会沾染到滤纸上，对实验产生影响；保鲜膜可以与钟罩边缘进行更紧密的结合，是平衡效果更好。

2.       用毛细吸管进行点样时，为保证点样半径足够小，应使毛细管内的液体高度低于1cm，迅速的点在滤纸上。若管内液体过高，可以先将毛细管的液体点一部分于干净的卫生纸上，降低管内液体高度。

3.       在通过移液管添加展层剂时，液体应缓慢放出，避免溅射到滤纸上，移液管拿出时也应该注意不要碰触滤纸。

4.       展层开始时不要使样品浸入展层剂中。

5.       吹风机吹干时切记用冷风吹干，以免温度过高使氨基酸变性。

附：生化一组各氨基酸实验结果

 

第二篇：氨基酸的纸层析法

氨基酸的纸层析法

一、实验目的

了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。

二、实验原理

以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。

将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。 在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）

Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。

用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。

本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有甘氨酸、苯丙氨酸组成。

三、实验仪器

1、新华滤纸

2、层析缸

3、细线

4、点样管

5、橡皮筋

6、电吹风

7、喷雾器

四、实验试剂

1、混合氨基酸

2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v）

3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中

五、实验步骤

1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画两个圆点（原点）。

2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在上面两个点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。

3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层（大约2~3小时）。

4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干（或烘箱60℃）烘干。

5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。

6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。

7、量取数值，计算各自的Rf值，与表中标准氨基酸Rf值比较，确定样品氨基

酸种类。

六、实验结果

Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

测量得出：

几何中心距底线距离H=12.38cm

H1=7.34cm H2=3.08cm H3=0.75cm

所以根据公式可以得出：

Rf1=H1/H=7.34/12.38=0.5929 苯丙氨酸

Rf2=H2/H=3.08/12.38=0.2488 酪氨酸

Rf3=H3/H=0.75/12.38=0.0694 精氨酸

七、实验分析

1、影响本次实验的因素有哪些？

点样线不能被没于层析液面，滤纸不能贴到容器壁上，点样时要一边点样一边用电吹风吹干，喷茚三酮—无水丙酮液时注意使溶液不倒流不间断。 室内温度会影响流速，所以温度要注意保持一致。