生命学院 生物化学实验

实验二 氨基酸的分离鉴定——纸层析法

一、 实验目的

1、 掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析待测样品的氨基酸成分。

2、 学习用纸层析法分离、鉴定氨基酸

二、实验原理

⑴ 纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。

⑵ 溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示：

⑶ Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

⑷ 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂

系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。

三、 实验器材

a) 大烧杯（5000mL）：1只/组

b) 毛细管。

c) 喷雾器：公用。

d) 培养皿：1只/组。

e) 层析滤纸（长22cm、宽14cm的新华一号滤纸）：1张/组。

f) 直尺、铅笔：自备。

g) 电吹风：1只/组。

h) 托盘、针、白线：1套/组。

i) 手套：1双/组。

j) 塑料薄膜：公用。

k) 小烧杯：50mL，1只/组。

四、 实验试剂

（1）扩展剂：将4体积正丁醇和1体积冰醋酸放入分液漏斗中，与5体积水混合，充分振荡，静置后分层，弃去下层水层。

（2）氨基酸溶液：0.5%的已知氨基酸溶液3种（亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸，脯氨酸氨酸），0.5%的待测氨基酸液1种。

（3）显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。

1

生命学院 生物化学实验

五、实验操作

检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。

（1）平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上，再把盛有约20mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中，用塑料薄膜密封起来，平衡20min。

（2）规划：带上手套，取宽约14cm、高约22cm的层析滤纸一张。在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A，在直线上做4个记号，记号之间间隔2cm，这就是原点的位置。另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B，在B线上以A、B两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单位），参见左图。

（3）点样：用毛细管浸液取样，点在这四个位置上。同一位置上需点2～3次，每点完一点，立刻用电吹风热风吹干后再点，以保证每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。每人须点4个样，其中3个是已知样，1个是待测样品。

（4）层析：用针、线将滤纸缝成筒状，纸的两侧 ，边缘不能接触且要保持平行，参见图3-3。向培养皿中加入扩展剂，使其液面高度达到1cm左右，将点好样的滤纸筒直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面在A线下约1cm），罩上大烧杯，仍用塑料薄膜密封。当上升到12～15cm，取出滤纸，剪断连线，立即用铅笔描出溶剂前沿线，迅速用电吹风热风吹干。

（5）显色：用喷雾器在通风厨中向滤纸上均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后立即用热风吹干，即可显出各层析斑点，参见右图。

（6）计算各种氨基酸的Rf值，并判断混合样品中都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实验报告上，见表3-2。

（7）实验完毕，倒掉用过的展层液和平衡液，将培养皿洗净，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。

计算 ： Rf= 原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

六、注意事项

⑴.点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面(即展层时样品可能达到的部分)。

2

生命学院 生物化学实验

⑵.点样斑点不能太大，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且点样后吹风温度不宜过高，以免样品变性(斑点发黄)。

⑶.展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。

⑷.展层剂要临用前配制，以免发生酯化，影响层析结果。

⑸.如果样品中溶质种类较多，且某些溶质在某一溶剂系统中的Rf值十分接近时，单向层析分离效果不佳，则可采用双向层析，即将样品点在一方形滤纸的角上，先用一种溶剂系统展层。滤纸取出干燥后，再将滤纸转90度角，用另一溶剂系统展层。所得图谱分别与这两种溶剂系统中作的标准物质层析图谱对比，即可对混合物样品中各成分进行鉴定。

3

 

第二篇：生物化学实验 氨基酸的纸层析法

实验    氨基酸的纸层析法

一、目的

了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。

二、原理

以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。

将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）

Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。

本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。

三、实验仪器

   1、 新华滤纸

   2、 层析缸

   3、 细线

   4、 点样管

   5、 橡皮筋

   6、 电吹风

   7、 喷雾器

四、实验试剂

1、混合氨基酸溶液（甘氨酸，苯丙氨酸），甘氨酸溶液，苯丙氨酸溶液

2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v）

3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中

五、试验步骤

1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）。

2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。

   3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层（大约2~3小时）。

   4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干（或烘箱60℃）烘干。

   5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。

   6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。

   7、量取数值，计算各自的Rf值，与表中标准氨基酸Rf值比较，确定样品氨基酸种类。（书上图谱横着看）

六、实验结果

1.标准氨基酸单向上行层析法

定性、定量测定：

将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。

甘氨酸层析点中心到原点的距离：0.4cm

苯丙氨酸层析点中心到原点的距离：3.2cm

原点到溶剂前沿的距离:10.8cm

在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）

Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

Rf(甘氨酸)= 0.4cm/10.8cm =0.037

Rf(苯丙氨酸)= 3.2cm/10.8cm =0.296

七、实验分析

由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。

注意事项：

1. 在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。防止扩散面积过大，使展层效果不佳或直接影响实验结果。否则分离不好，并且样品用量大，会造成“拖尾巴”的现象, 防止氨基酸斑点重叠。

2. 注意点样线要高于层析液面。防止点样氨基酸溶解于层析液中。滤纸不要贴在层析缸璧上。防止滤纸左右两端展层速度过快，影响实验结果。

3. 均匀喷上茚三酮—无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。

4．取滤纸前，要将手洗净，这是因为手上的汗渍会污染滤纸。并尽可能少接触滤纸。在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否则手指上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点.要将滤纸平放在洁净的滤纸上，不可放在试验台上，以防止污染。

5.展层结束后，切勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。

6.在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。

7.展层剂接触滤纸时一定要均匀、保持前沿线与滤纸平行。

8.风温度不宜过高，否则斑点变黄。

9.影响Rf值的因素有：

    ①物质本身的化学结构；

    ②展层所用溶剂系统；

    ③展层剂pH值；

    ④展层时的温度；

    ⑤展层所用滤纸；

    ⑥展层的方向(横向，上行或下行)。