新药临床实验常见问题的分析

国内创新药物申报量逐年增多，作为临床专业审评员，笔者有机会接触到前沿的临床试验资料。一年来，外科领域的创新药物有18项申报，其中有12项部分或全部由临床因素影响了注册进度或不能成功注册。笔者就临床方面的影响因素进行了整理，认为有两个方面的问题较为突出。一为忽视研发药物立题的考察，在12个问题品种中，有9个未对立题进行系统考察；一为临床试验的质量不能很好地满足注册要求，在12个问题品种中，共有4个品种进行了临床试验，但均没有很好地回答其立题，其中1个退审，3个可能需要进一步的临床试验支持。本文就临床试验中常见问题谈一些个人看法。

临床试验是在志愿者人群中进行的探索性试验,用以回答与药物、疫苗、其他治疗措施或改变已有治疗措施相关的安全性或/和有效性问题。通常，临床试验分为干预性试验试验和观察性临床试验。基于循证医学的考虑，药物研发过程中经常采用的为干预性临床试验，该类临床试验由于以证据为基础，受到业界和学界的推崇并广为接受，被认为是药物获准上市的必需基础。

一、临床试验中应重点关注的几个环节

所分析的4个临床试验均为干预性临床试验，笔者对不能满足注册需要而延迟注册情况进行了分析，主要集中在以下几个方面：（1）有效性不能得到确证，或有效性即使得到确证，但由于受选择适应症限制并不具有临床意义；（3）没有进行恰当的安全性数据分析；（4）没有进行系统的获益与风险评估。具体体现在以下几个环节。

1、假设检验

确证性临床试验主要用于提供有效性及安全性证据。在此类试验中，应根据试验目的, 首先提出定义假设，然后在试验完成后进行检验。验证性试验主要是对所提出的假设提供坚实的依据，必须就提出的有关安全性及有效性的每一个关键性的临床问题给予充分的回答。坚持按试验方案及标准操作步骤进行试验尤为重要。

举两个因假设未得到验证而延迟注册的实例，来进一步说明假设的重要性。一个为酸性成纤维细胞生长因子，拟用于治疗烧伤和慢性溃疡创面，其确证性临床试验设计为非劣效性试验设计，对照药为上市的碱性成纤维细胞生长因子，结果未能得出非劣效结论，申报单位又采用差异性检验，结果P>0.05，仍无法做出疗效判定，基于此，为确证该品疗效，要求申报单位补做了与安慰剂对照临床试验，并最终获准注册。另一个品种（名称略去），同样为非劣效试验设计，对照药为立止血，试验目的为求证试验药不劣于对照药，根据探索性试验设置检验假设，但是由于临床试验设计存在问题，没有全面地检索阳性药的文献情况，主要疗效指标以及界值的设定没有依据等原因，另外也没能得出非劣效结论，申报单位也采用差异性检验，结果P>0.05，同样无法做出恰当的疗效判定。

对于创新药物，如确证性临床试验的检验假设不能得到验证，就很难得出有效性结论。由于检验假设未得到验证，揭盲后而变更假设检验，一般而言，难以接受再次数据处理的结果。

2、试验设计

根据研究目的选择适宜的临床试验设计，才能最大程度回答与临床安全有

效性相关问题。

有一个延迟注册的例子，能很好地说明试验设计选择的重要性。某口服药物（名称略去）拟用于控制肾衰病人的高磷酸症或有高磷酸症倾向的病人，在申报临床试验阶段，考虑到品种特性，注册管理部门建议临床试验设计采用随机、双盲、对照研究方法。但是，在申报生产时，申报单位提供了采用自身交叉试验试验设计的临床试验报告。该试验以阳性药物醋酸钙为对照药，由于受交叉试验的限制，未设安慰剂组，也未设剂量对照，结果提示该品在主要疗效终点不如对照药。由于受临床试验设计的限制，不能提供出支持有效性结论，不能提供出更多的支持其注册的信息。

所以在确定临床试验方案时，应清楚了解每种临床试验设计都有一定适用范围和限制，根据临床试验目的选择适宜的临床试验设计以获得需要的信息。

3、剂量效应关系

临床试验的重要目的之一，在于确定恰当的治疗剂量。所谓恰当的治疗剂量，是指在适宜的适应症人群，在合适的治疗时机，所使用合适药物的合适剂量。恰当的治疗剂量确定，主要依据量效关系临床试验。该类试验能够观察到不同剂量条件下的受益和风险，在有效性方面提供剂量与效应的关系，在风险方面也能提供剂量与风险的关系，使得能在剂量确定时进行有效的受益与风险评估。

不设置恰当的剂量对照，会影响恰当的治疗剂量的判断。在某研究药物的临床试验报告中，其探索性临床试验设2单位和3单位两个剂量组，另设安慰剂对照，在2单位和3单位并未观察到量效关系，其不足在于选择剂

量时，未选择足够宽的剂量范围，所以不能选择出最佳剂量。

在进行量效关系剂量设计时，应注意以下几个方面：选择足够宽的剂量范围；能够捕捉到准确的量效关系曲线；设置低剂量组以用确定最小有效剂量（minED）；最大剂量不要太接近最大耐受量（MTD）；设置安慰剂组以确定其疗效；充置阳性药物对照，以利于判断疗效程度。

4、对照

对照的目的在于屏蔽干扰因素，以观察干预因素带来的治疗效应。对照一般有下述四种情形，安慰剂、无治疗、不同剂量或剂量方案的受试药物、以及不同的活性药物。还有一种对照为外部对照或历史对照，该种设计只能在特殊条件下使用。

通常建议在对照组中设安慰剂组，在剂量探索性研究中，如果不同剂量组疗效显示不出差别，该安慰剂组有助于判断该研究药物是否有效；如果量效关系研究中其量效关系仅显示出趋势，设安慰剂量可以判断其疗效程度。如果不能设安慰剂组，在剂量设计时应拉大剂量间距离、用药间隔或用药周期。在设安慰剂组时建议同时设立阳性对照，以便于判断其疗效的程度。设立阳性药物作为对照药时，应警惕所谓的Biocreep现象，防止上市药物的疗效可能与安慰剂没有区别。

有两个确证性试验，设立对照组均为阳性药物，未设安慰剂组，由于事先的定义假设未得到验证，所以其疗效尚不能确证。一般情况下，与安慰剂对照的临床试验所需样本品量比非劣效试验样本量小，如上述两个确证性临床试验中设置了或增设了安慰剂组，只要与安慰剂组的假设得到验证，同样可以肯定其疗效。

5、终点选择

干预性临床试验重点观察的是干预后效应，在确证性临床试验试验中，其主要观察终点则与其适应症直接相关。所以在确证性试验中，其观察终点应根据试验的目的，来选择有临床意义的观察终点。

在某研究药物（名称略去）的确证性临床试验中，申报单位选择了腹部外科手术入路创面渗血的止血为适应症，其有效性观察指标为腹壁创面止血时间和腹壁创面单位面积出血量，由于该手术路径渗血量不多，而且临床多采用电刀切开腹壁，在腹壁切开过程中，一般不需要辅助止血药物，选择此种适应症与疗效观察终点临床意义有待商榷。

根据试验目的进行终点选择，不同的终点提示的信息不同。一般情况下，在确证性临床试验应选择临床终点。但在一些特殊下，替代终点与临床终点相关性已经建立，临床终点较为困难或干扰因素较多时，也可选择替代终点，单独选择替代终点时应非常慎重。

6、利弊权衡

整合研究药物所有与有效性和安全性相关信息，进行总体的获益与风险评估。结合国内实际，一般在分析时重点关注如下问题：（1）目标适应症有效性；（2）明显安全性问题以及所能采取的防范措施；（3）量效关系，剂量与毒性的关系，适宜的剂量范围，以及用药方法；（4）获益与风险评估。

如碘化钾口服液拟用于治疗女性经前期乳腺增生引起的疼痛的临床试验，尽管在拟定剂量条件下有效性尚不能确立，但出现了1例严重的碘源性甲亢，就此改善生活质量的适应症而言，是不能接受的，在进行了利弊分析

后，技术审评建议不批准。

二、小结

临床试验过程中，应遵从药物研发的系统性规律，根据临床试验的目的不同，进行各个阶段的临床试验，来回答与目的直接相关的有效性或/和安全性问题，临床试验的逐步推进都是以临床试验证据作基础的。由于临床试验涉及的环节较多，本文仅就外科领域创新药物审评实践中遇到的问题进行了阐述，有很大局限性，仍很大空间需要大家去思考与探索。

 

第二篇：ELISA实验操作中常见问题分析

由于 ELISA(酶联免疫试验)具有灵敏度较高、特异性好的特点，已广泛应用于各种传染性疾病的筛查如肝炎、爱滋、优生优育等。虽然洗板只是ELISA实验重要环节中的一个，但作为专业的洗板机生产厂家，我们必须对影响ELISA实验结果各因素有一定的认识。优质的 试剂 ，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。如不注意，就易出现白板、花板、色弱和假阳性等现象。尤其是花板现象（就是空白、阴性、阳性对照以及室内质控孔结果正常，而标本孔的OD值却明显偏高）是各个厂家洗板机调试中经常遇到的问题。现将ELISA实验操作中注意事项总结如下，以期给大家带来一些启发，以改善洗板机的安装调试水平，提高临床检测质量。

    1 标本及采集、贮运因素

严重溶血，以 HRP 为标记的ELISA 测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性； 混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；如有 细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应； 标本凝固不全，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果； 采血试管洗涤不彻底、反复使用易交叉污染； 塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。

    血清标本宜在新鲜时检测，严重溶血标本禁用。一般说来，在 5 天内测定的血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG 聚合，使间接法的 试剂 本底加深。超过一周测定的需－20℃保存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使 抗体 效价跌落，所以测 抗体 的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存；最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性；血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。

2、试剂的影响

    ELISA 诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。由于历史的原因，人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA 反应 试剂 盒，因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类 试剂 盒的流行病学敏感度不够，稳定性也成问题。也有厂家坚持 试剂 盒高的流行病学敏感度，科学地对待反应结果。基因工程抗原较合成肽抗原有无可比拟的优越性，就HCV-ELISA 试剂 盒来讲，第一代产品为合成肽抗原，主要是HCV 特异性抗原决定簇的肽片段；第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅包括了HCV 的核心区片段；第三代产品基本上采用了基因工程抗原，而且这些抗原包括更多、更稳定、纯度更高的HCV 特异性抗原。第三代 试剂 的敏感度大大提高了。基因工程抗原与合成肽抗原的区别如下：

    基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或 酵母 菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点：

a.分子量大。合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。

b.稳定性好。包被的抗原的稳定性可使 试剂 盒的效期得到保证，早期以合成肽为包被抗原的 试剂 盒效期只有3-4 个月，采用基因工程抗原后效期大大延长了。

c.基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达，表达产物包含更多的抗原决定簇，可提高 试剂 盒的灵敏度，提高检出率。

d.纯化难度大。基因工程抗原的纯化技术难度较大。

    合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特点： a.分子量太小；b.一般只含有一个抗原决定簇；c.纯度高；d.稳定性差。

    国内乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为 89.4%—99.3%,78%—89%存在较大差异。有的厂家酶标板孔间A值差大于15%；标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。

?  选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳定性好、批间差小、操作方便省时的优良检测试剂，国家参比实验室每年对各厂家的试剂进行质量评估并定期公布评估结果，可作为选择试剂的主要依据。

?  要注意试剂的批号和出厂日期，虽然试剂的有效期多为 1年。最好选择刚出厂的试剂使用。

不同厂家的试剂不能混用。

    不同方法学的检测试剂，会使两对半结果出现一些不同。例如：在实际工作中常用 ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，建议试剂厂家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的问题。

3、操作技术的影响

操作过程的控制：

⑴ 严格按照试剂说明书进行操作。操作前将试剂在室温下平衡30～60min。

⑵ 加样后及时放人孵箱。标本较多时，要分批操作。按说明步骤严格控制操作时间，防止孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。

(3)封板温育时，各孔一定要封严，防止阳性标本的液体蒸发，产生周边现象从而导致“花板”的出现。

(4)用洗板机洗板时，保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干：还要防止针口有纤维蛋白或异物，这些异物在洗板的过程中易产生拖带现象而导致“花板”的出现。

(5)合理安排检测量，以免反应板过多造成洗板等待时间长。

(6)加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。

(7)显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用。

(8)加样时保持显色剂不外流；A、B液应避免接触金属器械。加终止液时应避免产生气泡。

(9)应保证酶标板清洁，整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸。以上的措施可以使“花板”降至最低限度。从而提高检测的特异性。并得到更准确、可靠的实验结果。

    加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性，直接影响检测结果。由于吸嘴构造特殊，导致清洗困难，加大了交叉污染的机会。建议用一次性吸嘴。加样器也要经常清洗，定期校准。加样时应将所加物加在 ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出。

    温浴影响，在建立 ELISA 方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原 抗体 反应一般在37℃经1-2 小时，产物的生成可达顶峰。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。由于公司的 试剂 盒温育是在空气浴中完成，采用水浴会造成值偏高或花板。另外温育中还有边缘效应，边上的值会偏高，建议为了客观的判断结果，将质控放在非边缘位置。96孔酶标板结构特别；易产生边缘效应，抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求，酶标板周围与内部孔升降温速率不同，造成周边与内部孔结果差异；干浴与水浴存在明显的差异，尽可能使用水浴，并要求固相板放入水中，减少受热不均，贴密封膜，防止污物浸入。

    洗涤在 ELISA 过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。ELSIA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA 操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。

    洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液，各种 试剂 盒的洗液不要混用。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。洗液需要稀释，应按要求稀释。配制洗液应用新鲜的和高质量的纯化水，电导率小于1.5μs/cm，洗液如果结晶应待其融解后配制。手洗条件一致性较差，对结果影响较大，防止洗液在孔内形成气泡。半自动与全自动冼板机使用不当也会影响结果，血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔全阻塞或半阻塞状态，造成未结合标记酶洗脱不彻底，导致“花板”造成假阳性或假阴性；所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况，及时纠正，洗板机不用时应用去离子水清冼几遍。

    保证洗板浸泡时间为 40 秒左右，孔内液体被洗板机吸得越干净洗涤效果更好，手工洗板

4.显色和比色

    TMB 经HRP 作用后，约40 分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2 小时后即可完全消退至无色。TMB 的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24 小时）不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA 结果吸光度的光度计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15 -30℃ ，使用前先预热仪器 15-30 分钟，测读结果更稳定。

    测读 A 值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm 波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，第一次在最适波长（W1），第二次在不敏感波长（W2），两次测定间不 移动ELISA 板的位置，最终测得的A 值为两者之差（W1-W2）。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

    肉眼判断结果时，显色浅不易观察，影响结果的准确性，必须使用酶标仪检测，以保结果一致性。

5.HooK效应影响

    随着ELISA一步法的应用，一些标本中抗原含量过高，产生HooK效应。影响检测结果，采用同步稀释测定或使用线性范围高的两对半定量法可以减HooK反应的发生。

6.干扰物质的影响

    有人认为大约 40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果；常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig (s)抗体、交叉反应物质和其它物质等。如RF因子可与标记二抗的FC段法结合造成假阳性，补体从C1q活化，使一抗和酶标二抗的抗体分子发生变构，Fc的C1q分子结合点暴露出来，则补体C1q可将二者连接起来造成假阳性，采用56℃30分钟灭活补体可降低假阳性率，高浓度的AFP（如孕妇），在储存过程中可能形成二聚体会导致本底过深影响检测结果。

7.药物的影响

    高效价的乙肝免疫球蛋白会与 HBsAg形成复合物，影响HBsAg的检出，所以一些HBsAg阳性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg检测会呈阴性反应，导致乙肝两对半少见模式的出现，如我们常遇到乙肝大三阳的孕妇，为阻断乙肝母婴垂直传播时，在孕第8、9、10月常规注射200mg乙肝免疫球蛋白，不仅影响孕妇HBsAg的检出；而且其所生产的生新儿也常出现HBsAg阴性，HBeAg 阳性和HBcAb阳性等少见模式、可能是乙肝免疫球蛋白属IgG抗体能通过胎盘进入胎儿体内与胎儿血液中的HBsAg结合形成复合物；则新生儿HBsAg检测呈阴性；用0.5M的盐酸处理标本1小时可提高出率。

    为预防乙肝，部分 HBsAg阴性人群在接种乙肝疫苗后的1—2周内，血清中可检出HBsAg成份，形成一过性HBsAg阳性，这可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg.，有方法能够把它检出；如电化学发光法，建议接种乙肝疫苗后1个月内不应作HBsAg检测。

8.抗原自身因素

    融合蛋白对基因工程抗原特异性的影响。以丙肝诊断 试剂 盒为例为例，因为包被的基因工程抗原为融合蛋白，包含了来自表达载体的一些序列可以与血清中抗大肠杆菌的因子发生反应而产生了可疑标本。

    少数 HBV感染后外周血中不含HbsAg。HBV感染后绝大多数感染者外周血中可出现HBsAg， 含量在5ng～600μg/ml之间。据文献报道，到目前为止在献血员中所发现的HBsAg 携带者最低含量为0.2 ng/ml。含量高者可达2000μg/ml以上。但有少部分HBV感染者血清HBsAg测定为阴性，如暴发性乙型肝炎、HBV的S基因发生变异等。急性重症乙型肝炎，肝细胞中以合成HBcAg为主，很少或不合成HBsAg，从而使外周血中无HBsAg。HBV的前S/S基因编码HBsAg，构成病毒外膜，根据所带亚型决定簇的不同分为adw、adr、ayw和ayr。a决定簇具有很高的免疫原性，在HBV的自然感染或注射HBsAg 疫苗可引起抗HBs应答。如S基因145密码子变异使得其原来的甘氨酸被精氨酸替代时，可致a决定簇的抗原性发生改变，使机体产生的抗体对变异株无作用，且可引起HBV感染患者血清中同时出现HBsAg和抗HBs。同时乙肝疫苗接种也不能有效预防此类变异病毒的感染。乙型肝炎病毒S基因的变异有自然变异和逃避免疫变异，变异可发生在多个部位，而且几处突变可同时存在，这些变异有助于病毒携带状态的持续存在。近来，有研究表明，前S1区丢失突变（氨基酸58～118）是引起HBsAg阴性的HBV感染的重要原因，S启动子位于前S1，是合成HBsAg的调节元件，前S1的丢失突变则会影响S启动子的功能，进而影响HBsAg的合成。

    总之，优质的 试剂，良好状态的仪器，排除各种影响因素的干扰和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。