实验五 蛋白质的性质实验——蛋白质及氨基酸的呈色反应

一、实验目的

1．了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。

2．了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。

3．学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。

Ⅰ 双缩脲反应

二、实验原理

尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。

因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。

三、材料、仪器与试剂

尿素；10%氢氧化钠溶液；1%硫酸铜溶液；2%卵清蛋白溶液

四、实验操作

取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10%氢氧化钠溶液约1ml，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。

向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%氢氧化钠溶液约2ml，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。

Ⅱ 茚三酮反应

二、实验原理

除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。

β—丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应。尿素、马尿酸、二酮吡唪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。

三、材料、仪器与试剂

蛋白质溶液；2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；0.5%甘氨酸溶液；0.1%茚三酮水溶液；0.1%茚三酮-乙醇溶液

四、实验操作

①取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1~2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。

②在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴0.1%

茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。

Ⅲ 黄色反应

二、实验原理

含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。

多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。

三、材料、仪器与试剂

鸡蛋清溶液；大豆提取液；头发；指甲；0.5%苯酚溶液；浓硝酸；0.3%色氨酸溶液；0.3%酪氨酸溶液；10%氢氧化钠溶液

四、实验操作

向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。

Ⅳ 考马斯亮蓝反应

二、实验原理

考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。

它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。在0.01~1.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度A595nm值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。

三、材料、仪器与试剂

蛋白质溶液（鸡蛋清∶水=1∶20）；考马斯亮蓝染液

四、实验操作

取2支试管，按设计的表要求进行操作。

五、思考题

1．茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调？并说明原因。

2．你能区分蛋白质茚三酮反应及其他氨基化合物茚三酮反应的结果吗？试解释之。

3．能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在？

4．哪些芳香基因（蛋白质中的、非蛋白质中的）可以与浓硝酸作用呈现黄色反应的阳性结果？

 

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