二、Bradford法
(一）、原理：
        考马斯亮蓝G250 ( CBB- G-250）与蛋白质结合后形成蓝色的化合物，在595nm有最大吸收峰，且蓝色的深浅与蛋白浓度成正比。这是一种快速、准确、重复性好的蛋白质定量方法。
       该方法快速、准确、干扰因素少。CBB- G-250在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在2小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的干扰。但较高浓度的十二烷基硫酸钠（Soldium dodecyl sulfate），Triton X－100等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照品来消除。

（二）器材及试剂                              

   1、器材
   A.  分光光度计
   B.  微量加样器
   C.  移液管、试管及试管架

   D.  坐标纸

   2. 试剂  

（1）考马斯亮蓝G-250溶液：

       称取CBB- G-250 100毫克 溶于 50 ml 95%(V/V)乙醇溶液中，然后加入100毫升  85%（V/V） 磷酸，最后加蒸馏水定容至1000毫升。

（2）0.14mol/L 氯化钠溶液（生理盐水）

（3）标准蛋白质溶液（0.1mg/ml）：

       精确称取10.0毫克牛血清白蛋白，用生理盐水定容至100毫升。

 (4)  血清样品(已稀释200倍)

(5)  层析样品

(三）、操作（标准曲线制作） ：
取7支试管按下表操作：

混匀，室温放置5分钟，在595nm测定各管O.D值并以蛋白浓度为横坐标，以O.D值为纵坐标绘制标准曲线．

以Bradford法测定层析分离蛋白内的蛋白浓度

    取试管从层析样品中各取20.0ul，加入生理盐水20ul,最后加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0ml，混匀，以595nm 波长测定二者光密度，在标准曲线上查出其蛋白浓度

以上需要购买的试剂有：1、标准蛋白质即牛血清白蛋白。

教学内容：

实验八考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量

【实验目的】

1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法

2. 熟练分光光度计的使用和操作方法

【实验原理】

    此方法是1976年Bradform建立。考马氏亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与595nm的吸光度成正比。

【器材与试剂】

器材 1.可见光分光光度计 2. 刻度移液管 3.移液枪 4. 新鲜小麦叶片或绿豆芽下胚轴等

试剂 1. 0.9%生理盐水

2. 考马斯亮蓝试剂 

       称取CBB- G-250 100毫克 溶于 50 ml 95%(V/V)乙醇溶液中，然后加入100毫升  85%（V/V） 磷酸，最后加蒸馏水定容至1000毫升。

3. 1000µg /ml蛋白质标准液 

标准蛋白质溶液（1000ug/ml）：

       精确称取100.0毫克牛血清白蛋白，用生理盐水定容至100毫升。

【实验步骤】

1. 标准曲线的制作

(1) 取试管6支，按下表进行编号并加入试剂。

(2) 另取试管6支，吸取上述各管蛋白质溶液0.1ml，加入3.0ml考马斯亮蓝G250试剂, 充分振荡混合，放置5min后，测定A595值。

(3) 分光光度法的基本原理和分光光度计的使用方法（分组实际操作、讲解）

注意事项：(1) 持杯方法

(2) 一定要开盖调T 零点，盖盖调T 100

(3) 波长选择

(4) 空白杯所装的溶液

(4) A595为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。

2. 样品提取液中蛋白质含量的测定

(1)蛋白质提取:称取样品约200mg，加蒸馏水5ml，匀浆，4000rpm离心10min，取上清液。残渣用2.0ml蒸馏水悬浮，4000rpm离心10min，合并上清液并定容至10ml。

(2)蛋白质含量测定: 取3支试管，各吸取样品提取液0.1ml，加入考马斯亮蓝G250试剂3.0ml，充分振荡混合，放置5min后，测 A595 值

(3) 根据A595值，在标准曲线上求出样品中蛋白含量。

3. 结果计算

      样品蛋白质含量（µg/g鲜重）＝a (µg) ×提取液总体积 (ml) / [测定所取提取液体积（ml）×样品鲜重（g）], a为从标准曲线上查得的蛋白质含量，单位为µg

【实验结果与分析】

写出实验报告

 

第二篇：考马斯亮蓝法测定乳与乳制品中蛋白质含量

Vol.17,2010,No.3

粮食与食品工业

　　　　CerealandFoodIndustry

标准与检测

考马斯亮蓝法测定乳与乳制品中蛋白质含量

冯　昕,王吉中,尧俊英,呼玉侠

1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院　(郑州　450002)2.上海奇泓生物科技有限公司郑州分公司　(郑州　450013)

摘　要:建立了一种测定乳与乳制品中蛋白质含量的方法6料,通过考马斯亮蓝比色法测定其蛋白质含量0mL范围内线性关系良好,线性相关系数为019993,15%,方法的检出限为0102g/100。

:;:B　　文章编号:1672-5026(2010)03-0057-03

1

1

1

2

Determinationofproteincontentinmilkanddairyproductsby

CoomassieBrilliantBluemethod

FengXin,WangJizhong,YaoJunying,HuYuxia

1

1

1

2

1.CollegeofFoodandBiologyEngineering,ZhengzhouUniversityofLightIndustry(Zhengzhou450002)

2.ZhengzhouFilialeofShanghaiChihongBiotechnologicalCompany(Zhengzhou450013)

Abstract:Adeterminationmethodofproteincontentofthemilkanddairyproductsisestablished.SixmilkanddairyproductsweretakenastestmaterialbyCoomassieBrilliantBluecolorimetrictodeter2minateproteincontent.Theresultsshowthattheworkingcurveinarangeof0～0118g/100mLleadsagoodlinearrelationship,thelinearcorrelationcoefficientis019993,theaveragerecoveryis98113%,therelativestandarddeviationislessthan5%,thedetectionlimitis0102g/100mLandthemethodissimple,reproducible,accurateandreliable.

Keywords:CoomassieBrilliantBluemethod;milkanddairyproducts;proteincontent

　　蛋白质是生命活动的基础物质,是构成人体新生组织、维持人体健康的重要成分,它具有许多生物学功能;蛋白质作为人体最重要的营养素之一,它的分离与定性、定量分析是食品、药学和生命科学研究中经常涉及的重要内容,也是生物化学和其他生物学科、食品检验、生物药物分离提纯和质量检验中最重要的工作。目前食品中蛋白质含量的测量方法有紫外吸收法、凯氏定氮法、福林酚比色法、考马斯亮

[1]

蓝法等。紫外吸收法在测定酪氨酸和色氨酸含

收稿日期:2010-02-26　　修回日期:2010-03-10

作者简介:冯　昕,女,19xx年出生,讲师,主要从事食品生物技术方面的教学与研究工作。

量差异较大的蛋白质时,有一定的误差;福林-酚比色法是灵敏度较高的方法之一,但是该法专一性较差,干扰物质较多,如酚类、柠檬酸、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用,且操作费时长,还要精确控制操

[2]

作时间。凯氏定氮法是测定粗蛋白质的经典方法,但由于样品中非蛋白质含氮化合物的干扰,使得测定结果不能完全反映被测样品中真实蛋白质的含量。考马斯亮蓝比色法是19xx年由Bradford等人建立的一种测定微量蛋白质的方法,考马斯亮蓝所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水微区具有亲和力,通过疏水作用与蛋白质相结合,形成的蓝色蛋白质染料复合物,在595nm处有最大吸光度,在

57

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标准与检测

一定的蛋白质浓度范围内,蛋白质染料复合物在595nm处的吸光度与蛋白质含量成正比,因此可用

[3-4]

于蛋白质含量的测定。

本试验采用考马斯亮蓝比色法测定了不同乳制品中蛋白质的含量并对该方法的线性关系、精密度、重复性、稳定性、回收率等方面进行了考察,旨在探索建立一种具有快速、简单、准确、抗干扰能力强、分析成本低廉等优点的测定乳与乳制品中蛋白质含量的方法。

冯　昕等:考马斯亮蓝法测定乳与乳制品中蛋白质含量

3)。

表1　不同蛋白质标准溶液的吸光度

蛋白浓度

/g?(100mL)

-1

00

0101010xxxxxxxxxxxx0118

吸光值010890115701287014350158601718

2.2　线性范围和检出限

1　材料与方法

1.1　材料和设备

2份生鲜牛乳:地;纯牛奶2份():工作曲线的蛋白浓度在0～0118g/100mL范

,。然后以试剂空3,检出限为,添加检出限浓度空

G-(分析纯)购自中国医药公司(生化试剂)购自西安沃尔森生物技术有限公司,其余试剂均为分析纯。

UV-762紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)。1.2　试验方法1.2.1　溶液的配制

标准蛋白溶液的配制:精确称取牛血清白蛋白100mg,用蒸馏水定容至100mL,配成110mg/mol的标准溶液。

考马斯亮蓝G-250溶液的配制:精确称取考马斯亮蓝G-250100mg,溶于50mL95%的乙醇,再加入120mL85%的磷酸,稀释定容至1000mL备用。1.2.2　乳制品中蛋白质含量的测定

分别准确移取一定量的乳与乳制品样品于试管中,加入410mL考马斯亮蓝G-250溶液,用蒸馏水定容至510mL,摇匀,在室温下反应5min,以空白(不加乳制品)溶液作参比溶液,分光光度计595nm波长处测定样品组的吸光度。

,9215%,偏差小于20%。2.3　精密度试验

对6份乳与乳制品样品进行精密度试验,按照1.2.2方法测定蛋白质的含量,结果表明蛋白质吸光度的RSD为0189%。2.4　稳定性试验

在同一乳与乳制品样品中加入410mL考马斯亮蓝G-250溶液,摇匀,在4h内,每隔1h测定1次蛋白质含量,计算其RSD值。由试验结果可知,同一乳品蛋白质含量的RSD为1140%,表明4h内溶液稳定性良好。2.5　重复性试验

取一定量乳与乳制品样品6份按1.2.2试验方法进行检测,计算其蛋白质含量的RSD值。结果表明蛋白质含量的RSD值为0195%,表明其重复性良好。2.6　加标回收试验

对2份生鲜牛乳、2份纯牛奶和酸酸乳、优酸乳样品分别进行加标回收试验,每个样品浓度测定3次,结果见表2。

表2　加标回收试验结果

样品号

123456

本底量

/g010352xxxxxxxxxxxx10311010125010113

加标量

/g010050100801010xxxxxxxxxxxx40

测定均值

/g010387xxxxxxxxxxxx10420010312010487

回收率

/%96xxxxxxxxxxxx21296109419

2　结果与分析

2.1　工作曲线的确定

在试管中分别精确移取牛血清白蛋白标准溶液

0、011、012、014、016、018、110mL,加蒸馏水至110mL,然后在各支试管中分别加入410mL考马斯亮蓝G-250溶液,摇匀,室温下反应5min,在595nm波长处测定吸光度,以牛血清白蛋白标准溶液浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准曲

2

线。回归方程为Y=010071X+010089(R=01999

58

结果表明,回收率范围为9419%～10219%,平均加标回收率为98113%,RSD<5%,准确度较

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粮食与食品工业　CerealandFood

IndustryVol.17,2010,No.3

高,符合测定要求。

[5-6]

2.7　本法与国标凯氏定氮法比较

对6份乳与乳制品样品进行两种方法测定的配对t检验,统计比较结果见表3。t=11628,P>011,说明两种方法无明显差异,利用考马斯亮蓝法测定样品的结果准确可靠。

表3　两种方法测定结果比较

样品号考马斯亮蓝法凯氏定氮法

生鲜牛乳生鲜牛乳纯牛奶纯牛奶

131523158

231843188

131063111

231113118

含量的测定方法,该法精密度高、稳定性和重现性

好,抗干扰能力强,对仪器要求较低,简单、快捷、易行、准确度高,很适合大批量的乳与乳制品样品的测定,但本文仅对乳与乳制品中蛋白质含量进行了测定,其中蛋白质的种类和单体含量有待进一步深入研究。除测定牛乳的蛋白质外,本法还可尝试推广到其他保健食品、植物蛋白饮料等的蛋白质测定。

[1.:中国轻工业出版

g/100mL

酸酸乳优酸乳

11151112

11081172-.

[][J].大学化学,2009,24(1):66-69.

[3]Bradford.Arapidandsensitivemethodforthequantitation

ofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein2dyebindinn[J].AnalyticalBiochemistry,1976(72):248-254.

[4]王爱军,王凤山,王友联,等.低浓度蛋白质含量测定方

2.8　干扰试验

,质复合物的吸光度,结果发现不同浓度的没食子酸和甘氨酸对考马斯亮蓝牛血清白蛋白复合物的吸光度没有明显干扰。

另外为检查强化剂对本试验是否有干扰存在,在试验条件下用加有强化剂(强化铁和锌)的奶粉做干扰试验,发现强化剂对试验亦无明显干扰存在,试验结果与凯氏定氮法测定结果无差异。

法的比较[J].中国生化药物杂志,2003,24(2):78-80.

[5]段光顺,王　浩,曹慧婕.纳氏试剂分光光度法测定乳与

乳制品中蛋白质[J].中国卫生检验杂志,2006,16(2):

238.

[6]贾忠建.乳及乳制品中蛋白质测定应注意的事项探讨

[J].中国卫生检验杂志,2006,16(11):1393.

3　结论

采用考马斯亮蓝比色法作为乳与乳制品蛋白质?行业信息

国家“营养强化大米重点研发生产基地”落户中粮

20xx年4月26日,国家公众营养改善项目重点倡导产品“营养强化大米”上市新闻发布会在国新办新

闻发布厅召开,中粮集团大米部成为首批“全国营养强化大米重点研发生产基地”。

营养强化大米是指在普通大米中添加了维生素B1、维生素B2、烟酸、叶酸和铁、锌等营养素。据介绍,营养强化大米未来将逐步推广,替代当前营养物不足的普通大米主导地位。

中国粮油(控股)有限公司副总经理、大米部总经理杨红表示,3月中粮旗下营养强化大米“全稻原米”已经在北京、上海等城市试销,6月以后这款产品将推向全国市场。“全稻原米”是大米部今年着手重点推广的大米产品,完整保留了普通白米加工过程中会流失的营养成分。此前,中粮旗下强化大米主要用于出口。

大米部还向大会捐赠了15“t全稻原米”,这批赠品后期将由中国红十字基金会转赠给北京芳草地国际学校等相关单位,接收单位将进行家庭健康状况调查和4个月食用的效果测评。

公众营养与发展中心吴秀林副主任表示

,大米部今后可加强与其沟通和合作,借助政府机构的权威性、严肃性,积极推动中粮米业的公信力、知名度。同时,借助政府调研机构的权威数据,对公众进行大米的营养知识普及。

该发布会由国家公众营养改善项目办公室、中国粮油学会营养分会和国家发改委宏观院公众营养与发展中心组织,旨在贯彻国办发(2001)86号文件《中国食物与营养发展纲要(2001-2010)》的精神、全面实施

(忠　我国食物强化战略。良)

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