实验2 蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)

实验三 蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)

一、目的

1.学习一种蛋白质染色测定的方法

2.掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法

二、原理

蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化,从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。

考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色,当它与蛋白质通过范德华键结合后,变为蓝色,且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律,可在595nm处比色测定。2~5分钟即呈最大光吸收,至少稳定1小时。在0.01~1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。该法操作简便迅速,消耗样品量少,但不同蛋白质之间差异大,且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时,改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强,比色杯不洗干净会影响光吸收值,不可用石英怀测定

三、器材与试剂

1.仪器

(1)分析天平;(2)具塞刻度试管10ml×8;(3)吸管 0.lml×I,lml×Z,5ml×I;(4)研钵;(5)漏斗;

(6)离心管10ml;(7)容量瓶10ml;(8)离心机;(9)721型分光光度计

2.试剂

  (1)标准蛋白质溶液 称取10mg牛血清白蛋白,溶于蒸馏水并定容至100ml,制成 100 pg/ml的原液。

  (2)考马斯亮蓝G-250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50ml 90%乙醇中,加入 85%(m/v)的磷酸 100ml,最后用蒸馏水定容到 1000ml。

此溶液在常温下可放置一个月。

3.材料

    植物种子

四、操作步骤

1.标准曲线的制作    取6支具塞试管,编号后,按下表加入试剂。

     盖上塞子,摇匀。放置2min后在595 nm波长下比色测定(比色应在 l h内完成)。以牛血清白蛋白含量(μg)为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘出标准曲线。

2.样品中蛋白质含量的测定

(1)准确称取约200mg绿豆芽下胚轴,放入研钵中,加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆,离心(4000r/min,10min),将上清液倒入10ml容量瓶,再向残渣中加入2ml蒸馏水,悬浮后再离心10min,合并上清液,定至刻度。

(2)另取1支具塞试管,准确加入0.l ml样品提取液,再加入0.9 ml蒸馏水,5ml考马斯亮蓝G-250试剂,充分混合,放置2min后,以标准曲线1号试管做参比,在595 nm波长下比色,记录吸光度。

3.结果处理

根据所测样品提取液的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(μg),按下式计算:

  样品蛋白质含量(μg/g鲜重)=(查得的蛋白质含量(μg)×提取液总体积(ml))/(样品鲜重(g)×测定时取用提取液的体积(ml))

六、注意事项

1.由于染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠,试剂背景值会因与蛋白质结合的染料增加而不断降低,因而当蛋白质浓度较大时,标准曲线稍有弯曲,但直线弯曲程度很轻,不致影响测定

2.测定工作应在蛋白质染料混合后2min开始,力争1hr内完成,否则会因蛋白质一染料复合物发生凝集沉淀而影响测定结果。

3.样品中的Tris、乙酸、2-巯基乙醇、EDTA等物质对实验结果有少量颜色干扰,可以在做标准曲线时可以用缓冲液代替蒸馏水,就可以将干扰扣除,

七、思考题

1.考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么?还有哪些蛋白质定量法?

2.如何正确使用分光光度计?

八、参考文献

鲁子贤.蛋白质化学.北京:科学出版社,1981

文树基.基础生物化学实验指导.西安:陕西科学技术出版社,1994

张龙翔.生物化学实验技术.北京:人民教育出版社,1981

 

第二篇:考马斯亮蓝

标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量

一、 标准曲线

一般用分光光度法测物质的含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此,制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。

二、 蛋白质含量测定方法

1、 凯氏定氮法

2、 双缩脲法

3、 Folin-酚试剂法

4、 紫外吸收法

5、 考马斯亮蓝法

三、 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作

(一)、试剂:

1、 考马斯亮蓝试剂:

考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4.7%(W/V)乙醇,8.5%(W/V)H3PO4。

2、 标准蛋白质溶液:

纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。

(二)、器材:

1、722S型分光光度计使用及原理()。

2、移液管使用()。

(三)、标准曲线制作:

试管编号 0 1 2 3 4 5 6

100ug/ml标准蛋白(ml) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

0.15mol/L NaCl (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4

考马斯亮蓝试剂 (ml) 5 5 5 5 5 5 5

摇匀,1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色

2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug),在坐标轴上绘制标准曲线。

1)、利用标准曲线查出回归方程。

2)、用公式计算回归方程。

3)、或用origin作图 ,测出回归线性方程。即A595nm=a×X( )+6

一般相关系数应过0.999以上,至少2个9以上。

4)、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应该在直线两侧。

(四)、蛋白质含量的测定:

样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品的A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。

一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算。

实验六 蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)

一、目的

蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一,承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础,也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质,提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法,简便快捷,灵敏度高,稳定性好,是一种较好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理,了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。

二、原理

考马斯亮蓝G-250是一种染料,在游离状态下呈红色,当它与蛋白质结合后变为青色。蛋白质含量在0~1000μg范围内,蛋白质一色素结合物在 595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用比色法测定。

三、仪器、试剂和材料

1.仪器

(1)分析天平

(2)具塞刻度试管 10ml× 8

(3)吸管 0.lml×I,lml×Z,5ml×I (4)研钵 (5)漏斗 (6)离心管 10ml

(7)容量瓶 10ml

(8)离心机

(9)721型分光光度计

2.试剂

(1)标准蛋白质溶液 称取10mg牛血清白蛋白,溶于蒸馏水并定容至100ml,制成 100 pg/ml的原液。

(2)考马斯亮蓝G-250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50ml 90%乙醇中,加入 85%(m/v)的磷酸 100ml,最后用蒸馏水定容到 1000ml。

此溶液在常温下可放置一个月。

3.材料

绿豆芽

四、操作步骤

1.标准曲线的制作 取6支具塞试管,编号后,按下表加入试剂。

考马斯亮蓝

考马斯亮蓝

盖上塞子,摇匀。放置2min后在595 nm波长下比色测定(比色应在 l h内完成)。以牛血清白蛋白含量(μg)为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘出标准曲线。

2.样品中蛋白质含量的测定

(1)准确称取约200mg绿豆芽下胚轴,放入研钵中,加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆,离心(4000r/min,10min),将上清液倒入10ml容量瓶,再向残渣中加入2ml蒸馏水,悬浮后再离心10min,合并上清液,定客至刻度。

(2)另取1支具塞试管,准确加入0.l ml样品提取液,再加入0.9 ml蒸馏水,5ml考马斯亮蓝G-250试剂,充分混合,放置2min后,以标准曲线1号试管做参比,在595 nm波长下比色,记录吸光度。

五、结果处理

根据所测样品提取液的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(μg),按下式计算:

样品蛋白质含量(μg/g鲜重)=(查得的蛋白质含量(μg)×提取液总体积(ml))/(样品鲜重(g)×测定时取用提取液的体积(ml))

六、注意事项

比色应在出现蓝色2 min~l h内完成。

七、思考题

1.考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么?还有哪些蛋白质定量法?

2.如何正确使用分光光度计?

参考文献

鲁子贤。蛋白质化学。北京:科学出版社,1981

文树基。基础生物化学实验指导。西安:陕西科学技术出版社,1994

张龙翔.生物化学实验技术。北京:人民教育出版社,1981

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