糖化酶固定化实验报告

学    号：      080500130      

姓    名：       黄兆峰        

专    业：     微生物工程      

其他组员：黄志成、李盟、苏温培

指导老师：       朱秋享        

实验时间：  2008.11.5—2008.11.7 

一、目的要求

本实验为酶工程综合实验，由学生自行设计实验方案，培养学生独立实验的能力；并掌握酶活测定方法，米氏常数测定，学习固定化酶的常用方法及固定化酶的表征。

二、基本原理

游离酶可通过各种固定化方法，增加其稳定性并且有利于连续化生产和重复使用。酶固定化后可用各种理化性质的变化来表征其效果。

酶活测定原理：糖化酶（即淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶）有催化淀粉水解的作用，从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1，4-葡萄糖苷键生成葡萄糖，反应生成的葡萄糖用次碘酸钾法定量测定，以表示糖化性淀粉酶的活力。

本次固定化酶使用的方法是包埋法，将酶、细胞或原生质体包埋在各种多孔载体中，使其固定化的方法成为包埋法。包埋法制备固定化酶、固定化细胞或固定化原生质体时，根据载体材料和方法的不同，可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类。以各种多孔凝胶为载体，将酶、细胞或原生质体包埋在凝胶的微孔内的固定化方法为凝胶包埋法。本次实验中具体使用的方法为海藻酸钙凝胶包埋法。

三、实验仪器及材料

1、实验用乳化机WL500CY、注射用筒50mL6号针头、冰箱、其他实验常用玻璃仪器

2、糖化酶、海藻酸钠、明胶

四、试剂配方

1、2%可溶性淀粉

   称取可溶性淀粉碎2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入已沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至100ml，此溶液需当天配制。

2、1mol/LpH4.5醋酸钠缓冲液

取无水醋酸钠8.024g，先在少量水中溶解，定容至1000ml。取分析纯冰醋酸5.78ml定容至1000ml。以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体积比为25：22混合即为所要求的缓冲液。

3、0.05 mol/L碘液：

称取25克碘化钾溶于少量水中，加入12.7克碘，溶解后定容至1000毫升贮存于棕色瓶中。

4、0.1 mol/L氢氧化钠溶液：

称取分析纯氢氧化钠4克溶解并定容至1000毫升。
5、1 mol/L硫酸 ：

吸取分析纯浓硫酸(比重1.84)55.5毫升，缓缓如入944.5毫升水定容至1000毫升。

6、0.1 mol/L硫代硫酸钠：

称取26克硫代硫酸钠和0.4克碳酸钠，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并定容至1000毫升，配制后放置三天再标定。

五、实验步骤

1、酶活测定

⑴ 操作步骤

取2％可溶性淀粉溶液25毫升加pH4.5醋酸缓冲液5毫升混匀于比色管，在40℃恒温水浴中预热5－10分钟加入待测酶液2毫升(空白以蒸馏水代替酶液)准确计时1小时。取出加入4滴20％NaOH终止酶反应，冷却至室温。取上述反应液5毫升于定容瓶中，先加入0.05mol/L碘液10毫升，再加0.1 mol/LNaOH 10毫升，摇匀暗处静置15分钟。加入 2N硫酸 2毫升。用 0.1mol/L硫代硫酸钠滴定至无色。其与空白消耗硫代硫酸钠毫升数的差值应在4~6之间，否则要适当调整酶液的稀释倍数。

⑵ 计算

酶活(mg/ml)=(A-B)*N*90.05*V1/V2/V3 *2

A—空白所消耗的Na2S2O3的毫升数；

B—样品所消耗的Na2S2O3的毫升数；

90.05—1毫升1N的Na2S2O3相当的葡萄糖毫克数；

V1—反应液总体积(32.20毫升)；

V2—吸取反应液样品体积(5毫升)；

V3-吸取酶液毫升数(2毫升)；

2—反应30min,换算成1h的酶活力系数所得的结果表示至整数；

N—Na2S2O3的当量浓度(0.1mol/L)。

2、米氏常数的测定

取1ml游离酶，分别以0.20%，0.30%，0.40%，0.50%，1.00%，2.00%浓度的可溶性溶液为底物，在40℃下反应10min，采用以上的方法测定游离酶活，做Line weaver-Burk双倒数曲线图，即以1/[S]为横作标，以1/v（反应初速度）为纵坐标。其斜率即为米氏常数。

3、糖化酶的固定化

将酶液15ml游离酶与3%的海藻酸钠150ml混合，然后加入3%的明胶溶液150ml混合乳化约10min，调pH为4，慢速搅拌并降温至5～10℃，通过6号注射针头将上述冷却液以5cm的高度注进1%氯化钙溶液中，立刻形成光滑的微球，然后保持温度为4℃，球在氯化钙溶液中被硬化30min，固定化酶被贮存在0～5℃冰箱。

4、固定化酶的酶活测定

⑴ 操作步骤

取2％可溶性淀粉溶液25毫升加pH4.5醋酸缓冲液5毫升混匀于比色管，在40℃恒温水浴中预热5－10分钟加入固定化酶5g(空白以蒸馏水代替固定化酶)准确计时1小时。取出过滤终止酶反应，冷却至室温。取上述反应液5毫升于定容瓶中，先加入0.05mol/L碘液10毫升，再加0.1 mol/LNaOH 10毫升，摇匀暗处静置15分钟。加入 2N硫酸 2毫升。用 0.1mol/L硫代硫酸钠滴定至无色。

⑵ 计算

酶活(mg/ml)=(A-B)*N*90.05*V1/V2

A—空白所消耗的Na2S2O3的毫升数；

B—样品所消耗的Na2S2O3的毫升数；

90.05—1毫升1N的Na2S2O3相当的葡萄糖毫克数；

V1—反应液总体积(32.20毫升)；

V2—吸取反应液样品体积(5毫升)；

N—Na2S2O3的当量浓度(0.1mol/L)。

5、固定化酶活力回收测定                  

固定化酶活力回收=固定化酶总活力/溶液酶总活力X100%

6、固定化酶半衰期测定

六、实验数据与数据处理

1、

表1  糖化酶酶活测定

2、

表2  糖化酶米氏常数测定HHHH

以1/[S]为横作标，以1/v（反应初速度）为纵坐标，做Line weaver-Burk双倒数曲线图，其斜率即为米氏常数。Km=0.0004/0.0015=0.267

                        图1  Line weaver-Burk双倒数曲线图

3、

表3 固定化酶酶活测定

4、固定化酶回收率的计算：

  100ml胶酶溶液相当的酶活力u＝总的固定化酶质量×固定化酶比活力

                         ＝45.6×7.85 =357.96(u)

 

315ml胶酶溶液相当于15ml酶溶液活力u＝

                                    =357.96/100×315=1127.57u

15ml酶溶液的总活力u＝

                    ＝19312/100*15=2896.8u

固定化酶的回收率ω％＝

                  ＝1127.57/2896.8×100％＝38.9%

5、固定化酶半衰期的测定

表4  固定化酶的半衰期测定表格

由下图得：t1/2=ln2/0.0068=110h（4天零14小时）

图2 固定化酶半衰期的测定

七．结果与讨论：

本实验采用包埋法对糖化酶进行固定化并对其Km，半衰期t2/1重要参数进行测定，随着人们对天然高分子载体的不断挖掘和探究,对其进行改性,或利用超临界技术、纳米技术、膜技术等来固定化酶,同时,开发新型、高效固定化酶反应器,进一步提高转化和生产能力是固定化酶技术发展的趋势。

以上实验得出实验数据如下：

误差分析：

（1）实验中要求采用的硫代硫酸钠溶液需放置三天才能使用，而我们没有做到这一点，这使结果发生偏差。

（2）由于在测固定化酶的活力过程中，固定化酶微球会浮在反应液表面，要使它们能与反应液均匀接触，要在反应过程中不断搅拌反应液，我们是隔一段时间去搅拌一次，而不是使它一直保持搅拌状态，所以测的结果有偏差。

（3）我们测定酶活的方法是采用滴定硫代硫酸钠法，由于我们操作的不够熟练，在滴定的过程中会多滴一两滴，这使我们的一些数据会偏大。

（4）测固定化酶活与固定化酶的回收率，没有在同一天做，固定化酶放置了一天，这使固定化酶的回收率测定出现偏差。

 

第二篇：糖化酶活力测定实验报告

华南农业大学

综合实验报告

实验项目名称：糖化酶活力测定

实验项目性质：综合实验

计划学时：2学时

所属课程名称：食品与发酵工业分析

班        级： 10级生物工程1班

姓        名：肖佩

学        号：201030620124

指导  老师：沈玉栋徐振林

一．实验原理

采用可溶性淀粉为底物，在一定的pH值与温度下，使之水解为葡萄糖 (还原糖)，以直接滴定法测定。

二．试剂及仪器

（1） 碱性酒石酸铜甲溶液（使用时等体积混合甲、乙溶液）： 甲液：称取15.693g硫酸铜(Cu₂SO₄·5H₂O)，0.05g次甲基蓝，用水溶解并稀释定容至1000mL； 乙液：称取50g酒石酸钠钾，54g氢氧化钠，4g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释定容至1000mL

（2） 0.1%标准葡萄糖溶液：准确称取1g无水葡萄糖（预先在100-1050C烘干），用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。

（3） pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液：

0.2mol/L乙酸溶液：量取11.8mL冰乙酸，用水稀释至1000mL；

0.2mol/L 乙酸钠溶液：称取27.2g乙酸钠（CH₃COONa·3H₂O），用水定容至1000mL；

pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液：取0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸钠溶液等体积混合。

（4） 0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL。

（5） 2%可溶性淀粉溶液：准确称取2g可溶性淀粉（预先于10-105 0C烘干），加少量水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。

（6） 固体曲

（7） 滴定管、电子天平、烧杯、恒温水浴锅、脱脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶

三．测定步骤

（1） 5%固体曲浸出液制备：称取5.0g固体曲（以绝干曲计），置于250mL烧杯中，加90mL水和10mL pH4.6乙酸－乙酸钠缓冲溶液，搅匀，于30℃水浴中保温浸1小时，每隔15min搅拌一次。用脱脂棉过滤，滤液为5％固体曲浸出液。

（2）固体曲糖化液的制备：吸取25mL 2％可溶性淀粉溶液，置于50mL容量瓶中，于30℃水浴预热10min。准确加入5mL 5％固体曲浸出液，摇匀，立即记下时间。于30℃水浴准确保温糖化1小时。迅速加入15mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液，终止酶解反应。冷却至室温，用水定容至刻度。

同时作一空白液：吸取25mL 2％可溶性淀粉溶液，置于50mL容量瓶中，先加入15mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液，然后准确加入5mL 5％固体曲浸出液，用水定容至刻度。

（3）定糖

空白液测定：吸取碱性酒石酸铜甲、乙液各5mL，置于100-150mL三角瓶中，准确加入5mL空白液，并用滴定管预先加入适量的0.1%标准葡萄糖溶液，使滴定时消耗的0.1%标准葡萄糖溶液在1mL以内，摇匀。于电炉上加热至沸腾，立即用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1min内完成。

糖化液测定：准确吸取5mL糖化液代替5mL空白液，其余操作同上。

四．计算

固体曲糖化酶活力定义：1g绝干固体曲，在30℃、pH4.6、1小时内水解可溶性淀粉为葡萄糖的毫克数。

式中：V₀——5mL空白液消耗0.1%标准葡萄糖溶液的体积（mL）

  V——5mL糖化液消耗0.1%标准葡萄糖溶液的体积（mL）

C——标准葡萄糖溶液浓度（g/mL）

50/0.5——0.5mL糖化液换算成50mL糖化液中的糖量（g）

100/5——5mL浸出液换算成100mL浸出液中的糖量（g）

W——绝干曲称取量（5.0g）

1000——g换算成mg

五．数据处理与分析

4.1.1数据处理

      表1 糖化酶活力测定实验滴定所用滴定液体积

六．数据处理

空白液：Vo=9.80mL

样品液：V=6.30mL。

代入公式可得，糖化酶活力=1400mg

七．结果讨论

实验结果表明试样糖化酶活力为1400mg，根据查找的资料可知本实验所测酶活力偏低。原因如下：

1.实验人员的在吸取、滴定等操作存在误差，导致实验结果有所偏差。

2.制备5%固体曲浸出液时，糖化酶没有完全浸出，造成分解淀粉量减少，滴定所用标准葡萄糖溶液增多，计算所得酶活力减少。

3.进行滴定时，在糖化液滴定过程中，起初由于糖化液浓度较大，滴定时间过短无法统计，后作10倍稀释测定，可能影响实验结果的测定。