ELISA双抗体夹心法

摘要：

ELISA双抗体夹心法(enzyme linked immunosorbent assay——sandwich technique)的原理是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检血清中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复 合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。以检测HbsAg为例。

找产品，上生物帮>> >>

相关专题

生物帮之抗体制备

【原理】

ELISA双抗体夹心法(enzyme linked immunosorbent assay——sandwich technique)的原理是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检血清中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。以检测HbsAg为例。

【材料】

酶标抗体(HRP-抗HBs-IgG)、抗HBs-IgG、待检血清

包被液 pH9.5 0.05 mol/L CB

稀释液 pH7.4 0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液

底物液 0.1 mol/L Na2HPO4(Na2HPO4·12H2O 35.8 g/L)5.14 ml，0.05 mol/L枸橼酸(10.5g/L)4.86 ml混匀，加入邻苯二胺(OPD)4 mg，置棕色小瓶中，临用时加30% H2O2 4.0μl，混匀。

终止液 2 mol/L H2SO4

温箱、酶标反应板、酶标分光光度计

【方法】

1. 包被 取包被液适当稀释的抗HBS-Ig 0.1 ml，加到聚苯乙烯反应板各孔中。加盖，4℃ 24h。次日用洗涤液充分洗涤3次，甩干。

2. 各孔内加不同稀释倍数的待检血清0.1 ml，同时加阳性和阴性对照血清，置43℃温箱60 min，移去液体。同前法洗涤3次，甩干。

3. 各孔内加稀释HRP-抗HBs-IgG 0.1 ml，置43℃温箱60 min。移去液体，同前法洗3次，甩干。

4. 各孔加底物液0.1 ml，置黑暗处20 min。

5. 各孔内加2 mol/L H2SO4 0.05 ml，终止反应。

【结果】

1. 目测法 阳性孔呈桔黄色，阴性孔无色或极浅黄色。

2. 比色法 用酶标分光光度计测A492nm，计算P/N值(为待测血清A492nm和阴性对照A492nm的比值)。如P/N2.1，结果为阳性，否则为阴性。

ELISA简便、敏感、特异。并酶标记抗体试剂制备容易、稳定、有效期长、因此推广很快，ELISA双抗体夹心法，但仅适用于二价或二价以上的大分子抗原的检测。

 

第二篇：ELISA操作步骤(双抗体夹心法)

ELISA操作步骤（双抗体夹心法）

1. 包被过程(注意设置空白对照,阴性对照):

将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体，(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)。 2 PBS洗3次，每次3分钟。

具体为.吸干或甩干孔内反应液；.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；吸干孔内液体，可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；.重复操作涤3次。

3. 加入待检测样品(建立合适的浓度梯度):

检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl。将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔100μl，置于37℃,40-60min。

4 PBS洗3次，每次3分钟。

5. 加入酶标抗体:

酶标抗体: 根据酶结合物提供商提供的参考稀释度进行或建立浓度梯度，37℃,30-60min之间，短于30min往往结果不稳定，每孔加100μl。

6 PBS洗3次，每次3分钟。

7. 加入底物液(现用现配):

TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl，底物加入量每孔100μl（TMB空白显色孔除外）,置37℃避光放置20-25分钟。

8. 终止反应:

每孔加入终止液50μl(2M H2SO4)终止反应, 此时蓝色立转黄色，于20min内测定实验结果。

9 结果判断:

可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。也可测吸光值：在ELISA检测仪上，TMB反应产物检测需要450nm波长，检测时一定要首先进行空白孔系统调零。用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示，当P/N大于2时作为抗体的效价即大于阴性对照吸光值的2倍，(数值的大小依具体检测要求而定)。