ELISA（双抗体夹心法）—检测HBsAg

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ELISA免疫实验技术

以已知抗体(抗HBs)包被载体，然后将含有抗原的待检标本加入，共同孵育后，抗原结合于包被抗体上，再加入酶标记特异抗体(酶标抗HBs)，酶标抗体连接到抗原上，最后加入底物溶液，根据颜色反应来判定抗原含量。

【材料】HBsAg试剂盒，本试剂盒含:

1、包被抗-HBs反应条

1瓶

2、酶结合物

1瓶

3、HBsAg阳性对照

1瓶

4、HBsAg阴性对照

1瓶

5、洗涤液:用前每瓶作1：20稀释

1瓶

6、显色剂(TMB)A

1瓶

7、显色剂(TMB)B

1瓶

8、终止液

1瓶

【方法】

1、加入待测标本每孔0.05ml，并设HBsAg阳性对照2孔，HBsAg阴性对照2孔，空白对照1孔，然后加入酶结合物每孔1滴(0.05ml、空白对照孔不加)，充分混匀后置37℃孵育30分钟。

2、洗板:弃去反应条孔内液体、拍干、用洗涤液注满每孔，弃去拍干，反复五次后拍干。

3、显色剂:先加显色剂A每孔1滴(0.05ml)，然后再加显色剂B每孔1滴(0.05ml)，混匀，37℃孵育10分钟。

4、每孔加终止液1滴(0.05ml)，混匀。

【结果】

比色法:波长450nm，先用空白孔校零点，然后读取各孔光密度值。

样品OD值/阴性对照平均OD值≥ 2.1判断为阳性，否则为阴性。

备注：阴性对照平均OD值低于0.05作0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。阳性对照OD值≥0.8，实验结果有效。

【注意事项】

1、试剂盒置2℃～8℃保存。

2、使用前试剂应摇匀，并弃去1～2滴后垂直滴加。

3、从冷藏环境中取出试剂盒内全部瓶装试剂及待测标本所需微孔条，置室温平衡30分钟后再行测试，余者应及时封存于冰箱中以备后用。

4、待测标本不可用NaN3防腐。

5、不同批号试剂请勿通用。

6、结果判断须在10分钟内完成。

7、若浓缩洗涤液出现结晶时，请置37℃至溶解。

 

第二篇：双抗体夹心ELISA法检测HIV_1p24抗原的初步建立

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中国艾滋病性病　20xx年6月第14卷第3期　　ChinJAIDSSTD　Vol114No13Jun.2008

?论著?

双抗体夹心ELISA法检测HIV21p24抗原的初步建立

侯俊,胡燕,沈宏辉,朱雷,王志杰,雷厉,貌盼勇

(解放军302医院传染病研究所病毒研究室,北京　100039)

摘要:目的　建立敏感、特异的艾滋病病毒Ⅰ型(HIV21)ELISA)检测方法,为

试剂盒的研制奠定基础。方法　用纯化的基因工程p24(单抗)及多克隆抗体(多抗),用单抗包被酶标板,p24抗原的ELISA检测方法。进一步与美国杜邦公司的HIVHIV感染者血清和50份健康献血员血清中的p24抗原,;,测定试剂的灵敏度。结果　两种方法检测88份HIV感染者血清和50p24抗原结果均为阴性(符合率为100%);自建ELISA法检测HIV21p24抗原的灵敏度为100pg/ml。结论　初步建立了检测HIV21p24抗原的ELISA法,与国外同类试剂比较,本法的特异性和灵敏度均接近国外同类试剂,有较好的特异性和灵敏度,为进一步研制HIV21p24抗原ELISA检测试剂盒打下了基础。

关键词:艾滋病病毒Ⅰ型;p24抗原;酶联免疫吸附试验中图分类号:R512191　　文献标志码:A　　文章编号:1672-5662(2008)03-0226-03

Studyofdouble2antibodysandwichedELISAmethodtodetectHIV21p24antigen　HOUJun,HUYan,SHENHong2hui,etal1(DepartmentofVirology,InstituteofinfectiousDiseases,302HospitalofPLA,Beijing100039,China)

Abstract:Objective　ToestablishasensitiveandspecificmethodforthedetectionofHIV21p24antigen1Methods　MonoclonalandpolyclonalantibodieswereobtainedfromimmunitymiceandrabbitsusingpurifiedHIV21p24antigenex2pressedbygeneticengineering1AntibodieswereconjugatedwithHRP1AELISAmethodtodetectHIV21p24antigenwasestablished1EightyeightHIVpositiveseraand50normalseraweredetectedsimultaneouslybyDopontHIV21p24anti2bodyreagentandtheELISAmethodestablishedbyourlaboratorytoconfirmitsspecificity1Results　Theresultsofdetect2ingHIV21p24antigenof88positiveseraand50normalserabytworeagentswereallnegative,whichshowedthattheco2incidentratewas100%1ThesensitivityofourreagenttodetectHIV21p24antigenwas100pg/ml1Conclusion　TheELISAmethodsofdetectingHIV21p24antigenhasbeenpreliminaryestablished1Ourreagenthasgoodsensitivityandspecificityascomparedwithimportedones,whichhaslaidanimportantbasisfordevelopingamoresensitivediagnosticreagentkitfordetectingHIV21p24antigen1

Keywords:HIV21p24;Monoclonalantibody;ELISA

　　近年来艾滋病病毒(HIV)感染在全世界迅速蔓

延,我国自19xx年发现艾滋病(AIDS)以来,HIV/AIDS的流行趋势亦日趋严重,因此建立、发展与完善HIV检测方法对于HIV/AIDS的防治尤为重要。众所周知

,HIV感染机体后,在抗体产生前有一个窗口期,由于重组蛋白及人工合成多肽的应用,使检测HIV抗体的敏感性不断提高,已使HIV感染的窗口期大大缩短,其核心抗原p24却在急性感染期就可出现,用常规检测HIV的方法查不到HIV抗体,且目

收稿日期:2007-07-04;修回日期:2008-03-24

作者简介:侯俊(1973-),女,重庆市人,硕士,研究方向为病毒学、免疫学。

通讯作者:貌盼勇,Email:pymao302@yahoo1com1cn。

前没有一种血清学筛选方法可在这一阶段检出HIV抗体。因此,HIV21p24抗原的检测日益受到世界各国的高度重视。我国p24抗原检测尚处研制、开发阶段,国外进口试剂盒价格昂贵,不适于大规模检测,因此开展了检测HIV21p24抗原的研究工作,并初步建立了检测HIV21p24抗原的双抗体夹心ELISA法。

1　材料与方法

111　抗原及抗体　p24抗原为重组基因工程表达抗

原,含HIV21p24抗原的全基因序列(约690bp),经纯化、鉴定,确定其特异性。抗p24蛋白单克隆抗体(单抗)细胞株及腹水抗体均由本室筛选、制备,本室共筛选出2株特异性较高的单抗细胞株,编号为

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1B3、5C2;饱和硫酸铵法纯化单抗腹水,纯化的抗体直接用于包被或标记辣根过氧化物酶(HRP)[1,2]。

大,但对阴性血清有较明显的影响,因此选择合适的包被抗体浓度对p24抗原检测灵敏度的高低至关重要。在本研究中选择1B3、5C2的最佳包被浓度均为μg/孔联合包被(表

1)。115

表1　抗体包被浓度的选择

抗体

1B3多克隆抗体(多抗)为兔抗p24抗原血清抗体,也由本

室制备。用本室表达、纯化的HIV21p24抗原免疫兔子,经硫酸铵沉淀粗纯化后,再经离子交换层析纯化,ELISA检测其活性,纯化的抗体直接用于包被或标记HRP。

112　抗体的标记　用HRP分别标记鼠抗HIV21p24单抗和兔抗HIV21p24多抗,HRP为德国BoehringerMannheim公司产品抗体浓度(μg/孔)

2241+1115+1152+22125+2125

3+3

p24抗原(+)p24抗原(-)

抗体和酶的比重为1∶1,夜,然后以0102mol/14℃,其他参见常规标记方法[3113　双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法的建立　0105mol/LpH916的碳酸盐缓冲液稀释包被抗体至包被浓度,加入酶标板(丹麦产NUNC板)μ100l/孔,置4℃过夜,甩干;含30%小牛血清的PB2ST(0102mol/LpH714PBS含0105%Tween220)封

μ闭200l/孔,37℃1小时,甩干,以PBST洗板1次;

μ加入样品稀释液(含10%Trinton2100)5l/孔,然后加

μ入待检测血清50l/孔,设阴、阳对照各3孔,37℃30

分钟,以PBST冲洗5次,甩干;将HRP标记的抗体

μ稀释后加入酶标板(50l/孔),37℃30分钟,以PBST

μ冲洗5次,甩干;加入底物液和TMB(各50l/孔),

μ37℃10分钟;加入2mol/LH2SO450l/孔终止反应,于450nm测吸光度(A值)。以P/N值判定结果

[4]

血清A值

110xxxxxxxxxxxx4201122511365113831145011605血清A值0107201078xxxxxxxxxxxx710xxxxxxxxxxxx501153

212　酶标记抗体工作浓度的选择及灵敏度的测定　

μg/孔)单抗,以最佳浓度联合包被1B3、5C2(各115分别以不同稀释度的酶标多抗检测不同稀释度的p24抗原标准品,表2可见,当酶标多抗的稀释度为1

∶1000时,能检测到5pg的p24抗原,其检测灵敏度为100pg/ml。用健康献血员系列稀释的p24抗原标准品和1份阴性血清,分别以自建夹心法和杜邦p24抗原检测试剂同时检测HIV21p24抗原,自建夹心法检测的最大灵敏度为100pg/ml,而杜邦试剂可检测到50pg/ml,要高于自建试剂(表3)。

表2　酶标记物工作浓度的选择

酶标多抗

稀释度1∶10001∶11001∶12001∶1500

p24抗原标准品(pg/ml)A值20xxxxxxxxxxxx12901093

10xxxxxxxxxxxx09901079

5001092010670109401071

p24抗原(-)

,

大于2倍P/N为阳性,反之为阴性。

114　灵敏度测定　美国杜邦公司(DOPONT)HIV21p24抗原检测试剂盒提供的检测灵敏度的p24抗原标准品(014ng/ml),用正常人血清系列稀释至50pg/ml,测定试剂的灵敏度。115　抗原检测　采用上述建立的方法及杜邦HIV21p24抗原检测试剂同时检测分别从云南、吉林收集到的HIV21抗体阳性血清标本88份;解放军301医院健康献血员血清50份。阳性对照血清由基因工程表

μg,溶于1ml正常人血清中;阴性对照达p24抗原50

血清来自北京地区健康献血员。其操作均严格按试剂说明书进行实验。

血清A值01048010520105801058

表3　自建夹心法和杜邦试剂检测HIVp24抗原灵敏度的比较

试剂自建夹心法试剂杜邦试剂

p24抗原标准品(pg/ml)A值2000113101171

1000112701120

500109201102

p24抗原(-)

血清A值0104801050

213　检测HIV21感染者及健康献血员血清中的p24

抗原及确定其特异性　应用2株特异性较高的单抗建立的检测HIV21p24抗原的ELISA法,和美国杜邦公司的HIVp24抗原检测试剂同时检测88份我国收集的HIV21感染者及50份健康献血员血清中的p24抗原,结果均为阴性,其检测符合率为100%。与国外同类试剂比较,本法的特异性和灵敏度均接近国外同类试剂,有较好的特异性和灵敏度。

2　结果

211　包被抗体及浓度的选择　将纯化的1B3、5C22

株单抗腹水,分别以不同的浓度单独及联合包被酶标

板,以双抗体夹心ELISA法检测p24抗原阳性、阴性血清。包被抗体浓度的改变对阳性血清A值影响不

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3　讨论

由于HIV感染后从感染初期发展为艾滋病的全

过程,时间长,临床表现错综复杂,所以早期p24抗原的检测占有极为重要的地位。为此美国FDA制定了对献血员进行p24抗原检测的法规[5]。由于p24抗原水平的检测不仅对HIV感染的诊断,而且对病人的抗病毒治疗效果的评价等有重要价值,因而目前国际上对p24抗原检测方法的研究非常重视[6-8]。本研究从本室制备的2手,构建了检测HIV21体ELISA法,度。,为了减少混合包被时抗体间空间屏蔽效应,进一步细分了两种抗体的浓度。通过实验优选,最终确定抗体1B3、5C2的

μg/孔联合包被,酶标抗体的稀释包被浓度均为115

度为1∶1000时对p24抗原检测的灵敏度和特异性

最好,其检测灵敏度为100pg/ml。考虑到单抗的纯度及亲和性远比多抗的好,曾尝试过用单抗按一定浓度包板,用酶标记单抗建立ELISA检测方法,和用多抗包板、用多抗酶标物及用单抗酶标物检测系列稀释的p24抗原,但效果均不理想。可能是因为单抗的抗原决定簇比较单一,只能结合特异的抗原位点,故其酶标放大效果不好;而用多抗包板结合的抗原位点又太杂,其特异性不好。综合其利弊我们选用单抗包板,用多抗进行酶标记,初步建立了检测p24抗原的双抗体夹心ELISA法,其灵敏度和特异性均远远高于其他包被及标记方法。

应用该法和美国杜邦HIV21p24抗原检测试剂同时检测88份HIV感染者血清及50份健康献血员血清中的p24抗原,结果均为阴性(但检测88份HIV感染者血清时自建ELISA法有一份A值为0112,其余结果均<011,而杜邦试剂除检测到该份血清外,还检测到一份A值>011的血清,其结果分别为01109、01104,但均未达到阳性判定值)。这可能和血

清标本采集时间有关,因为只有在HIV感染早期和

AIDS发病期,感染者血液中才有HIV的核心蛋白p24出现,在病情发展阶段,p24抗原与抗体形成抗原抗体复合物,阻碍了抗原的检测。与国外同类试剂比较,本法的特异性和灵敏度均接近国外同类试剂,有较好的特异性和灵敏度。本检测法虽能检测100pg/ml的p24抗原,距,针对这些问题拟从,进一步提高其检测的,为研制HIV21p24抗原ELISA检测试剂打下基础。

参考文献:

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-7011

[3]黄帧祥.医学病毒学基础及试验技术[M]1北京:科学出版社,

19901

[4]SterlingTR1HooverDR1AstemborskiJ1etal1Heat-denaturedhu2manimmunodeficiencyvirustypeⅠprotein24antigen:prognosticvalueinadultswithearly-stagedisease[J]1JInfectDis12002,186(8):11811

[5]RecommendationsfordonorsscreeningwithaLicensedtestforHIV21p24antigen[J]1FDA1U1S1A11995Aug1

[6]OndoaP,DieveTN,VereeckenC,etal1EvaluationofHIV21p24anti2genemiaandlevelofCD8+CD38+TcellsassurrogatemarkersofHIV21RNAviralloadinHIV212infectedpatientsinDakar,Senegal[J]1JAcquirImmuneDeficSyndr,2006,41(4):416-4241[7]SchupbachJ,TomasikZ,KnuchelM,etal1OptimizedvirusdisruptionimprovesdetectionofHIV21p24inparticlesanduncoversap24reac2tivityinpatientswithundetectableHIV21RNAunderlong2termHAART[J]1JMedVirol,2006,78

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[8]DoddRY1TransfusiontransmittedHIV[J]1VoxSang,1996,70(Supp

13):11

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