饼干中菌落总数与大肠菌群的测定

GB/T4789.24  食品卫生微生物学检验   糖果，糕点，蜜饯检验

一、检测对象

 散装饼干，小包装饼干

二.仪器用具

1仪器

高压蒸汽灭菌锅、电热干燥箱、恒温培养箱（36℃±1℃）、冰箱（2℃-5℃ ）、电子天平、电炉等。

2用具

无菌吸量管（1mL）、放大镜或菌落计数器、pH计或精密pH试纸、灭菌试管平皿(直径9cm)、刻度吸管、采样瓶、小倒管等。

三．食品的采样方法

采样应遵循无菌操作程序，采样工具和容器应无菌、干燥、防漏，形状及大小适宜。

1.即食类预包装食品

取相同批次的最小零售原包装，检验前要保持包装的完整，避免污染。

2. 散装食品或现场制作食品

根据不同食品的种类和状态及相应检验方法中规定的检验单位，用无菌采样器现场采集5倍或以上检验单位的样品，放入无菌采样容器内, 采样总量应满足微生物指标检验的要求。

3. 采集样品的标记

应对采集的样品进行及时、准确的记录和标记，采样人应清晰填写采样单（包括采样人、采样地点、时间、样品名称、来源、批号、数量、保存条件等信息）。

4.5 采集样品的贮存和运输

采样后，应将样品在接近原有贮存温度条件下尽快送往实验室检验。运输时应保持样品完整。如不能及时运送，应在接近原有贮存温度条件下贮存。

四．菌落总数的测定

1.菌落总数aerobic plate count：食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。

2.   GB 4789.2－2010   菌落总数测定流程

检样25 g(mL)样品+225 mL稀释液，均质

          ↓

10 倍系列稀释

       ↓

选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液，各取1 mL 分别加入无菌培养皿内，每皿中加入15 mL～20 mL平板计数琼脂，混匀

↓36 ℃±1 ℃ ，48 h± 2 h

培养，计数各平板菌落数

          ↓ 

报告

2.菌落计算公式

有两个稀释度的菌落数

在合适范围，

按照如下公式计算：

N = ΣC / [n1 + (0.1×n2) ] ×(d)

N = 样品中菌落数

ΣC =平板菌落数之和

n1 = 含合适范围菌落数的第一稀释度（低）平板数

n2 =含合适范围菌落数的第二稀释度（高）平板数

d = 第一稀释度（低）

3. 平板计数琼脂培养基

成分

A胰蛋白胨       5.0g

B 酵母浸膏       2.5 g

C 葡萄糖       1.0 g

D 琼脂         15.0 g

E 蒸馏水        1000 mL

pH  7.0 +/- 0.2

制法

将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH.分装试管或锥形瓶，经121℃高压灭菌15min.

五．大肠菌群的测定

1.GB 4789.3－20##大肠菌群计数

a.检样25 g+225 mL稀释液

b.适当十倍稀释样品

c.选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9 mL LST肉汤并加有导管），每管接种1 mL

d.36℃ ，24 ± 2 h ~48 ± 2 h

e.没有产气管有产气管,报告阴性

有产气管,接种BGLB肉汤管,36 ± ℃，48 ±2h,查MPN表报告结果（大肠菌群）.

有产气管,接种EC肉汤,44.5±0.5 ℃ （水浴培养）,24 ± 2 h ~48 ± 2 h.产气管接种EMB平板（36℃、18~24 h）.从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接种LST复检产气,查MPN表报告结果（大肠杆菌）

2．培养基

Ⅰ .LST

成份

 胰蛋白胨或 胰酪胨        20.0 g

 乳糖                  5.0 g

 氯化钠                5 .0g

磷酸氢二钾           2.75g

磷酸二氢钾           2.75g

月桂基硫酸钠         0.1g

 蒸馏水                1000 mL

pH   6.8 +/- 0.2

制法

将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH.分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min.

Ⅱ、BGLB

成份

蛋白胨        10.0 g

 乳糖                  10.0 g

牛胆粉溶液             200ml

0.1%煌绿水溶液    13.3 ml

蒸馏水               800 mL

pH  7.2 +/- 0.1

制法

将蛋白胨 , 乳糖 溶解于500ml蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200ml，用蒸馏水稀释到975ml,调节pH,再加入0.1%煌绿水溶液13.3 ml，用蒸馏水补足到1000ml,用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min.

Ⅲ.EC肉汤

成份

胰蛋白胨        20.0 g

3号胆盐（或混合胆盐） 1.5g

 乳糖                 5 g

磷酸氢二钾          4g

磷酸二氢钾           1.5g

氯化钠                5 .0g

蒸馏水              1000 mL

pH  6.9 +/- 0.2

制法

将上述成分混合，溶解于蒸馏水中，调节pH.分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min.

六．霉菌和酵母计数

1.设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

冰箱：2 ℃～5 ℃，恒温培养箱：28℃±1 ℃， 均质器(不能旋转刀)， 恒温振荡器， 显微镜：10×～100×， 电子天平：感量0.1 g，无菌锥形瓶:容量500mL、250 mL， 无菌广口瓶：500 mL， 无菌吸管：1 mL(具0.01 mL 刻度)、10mL(具0.1 mL 刻度)， 无菌平皿：直径90mm， 无菌试管: 10 mm×75 mm， 无菌牛皮纸袋、塑料袋。

2. 培养基和试剂

马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基：见附录A 中A.1。

孟加拉红培养基：见附录A 中A.2。

 马铃薯－葡萄糖琼脂培养基，附加抗菌素。

孟加拉红培养基。

灭菌蒸馏水。

3 操作步骤

3.1 样品的稀释

3.2 根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液于2 个无菌平皿内。同时分别取1mL样品稀释液加入2 个无菌平皿作空白对照。

3.3培养

待琼脂凝固后，将平板倒置，28 ℃±1℃培养5 d，观察并记录。

3.4 菌落计数

肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（colony forming units，CFU）表示。选取菌落数在10 CFU～150 CFU 的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。

4.结果与报告

计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。

 

第二篇：糕点中菌落总数和大肠菌群的测定

试论“蛋糕菌落总数测定中应注意的几个问题”

王文娟 姜卫博

（铜川市产品质量监督检验所 陕西铜川 727031）

内容提要 菌落总数的多少是用来判定食品被细菌污染的程度及其卫生质量状况，菌落总数在各类食品及卫生细菌学检验中均为必检项目。菌落总数的检测过程非常严格，为了保证检验结果的准确可靠，我们以蛋糕为例，在其菌落总数检测过程中，应注意以下几点细节性问题。

关键词 菌落总数 测定 注意 问题

菌落总数的测定是用来判定食品被细菌污染的程度及其卫生质量，也可以应用这一方法观察食品中细菌的性质以及细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据。目前，菌落总数检测在各类食品及卫生细菌学检验中均为必检项目。

一、菌落总数的定义

菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。

二、蛋糕的取样

样品采集时，用灭菌镊子夹取不同部位样品200g，放入灭菌容

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器内，采取后立即送检。具体时间应为2小时内送达检验室。

三、蛋糕中菌落总数的测定

1、培养基的配制灭菌

配制4.5%的营养琼脂及0.85%的氯化钠溶液并分装于300ml的三角瓶及试管中加塞进行高压灭菌20分钟。配制75%的酒精棉球作为检验菌落总数的试剂。刻度吸管、培养皿彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质进行包扎后灭菌15分钟。试剂灭菌后最好在当天使用，否则需增加灭菌时间5-10分钟，并放置于0-4℃冰箱中备用。为了保证检验过程的完全无菌，刻度吸管的上方，需塞入脱脂棉包扎后经灭菌再使用。

2、试验室的前处理

紫外线灯打开30分钟后关闭，停留30分钟后方可进入试验室进行检验，取营养琼脂在水浴锅进行预热，待无凝固后方可使用。为了保证检验结果的准确性，微生物检验室以两人以内为度。

3、试样的前处理

进入无菌室后，先打开酒精灯，用酒精棉球擦试手及样品外包装，如为原包装，用灭菌镊子夹下包装纸，采取外部及中心部位25g，加入225ml灭菌生理盐水中，最好置均置器中以8000-10000r/min的速度处理1min，做成1：10的均匀稀释液，用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）振摇试管，混合均匀，做成1：100的稀释液。另取1ml灭菌吸管，按上条操作顺序，做10

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倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1ml灭菌吸管。

4、接种、培养

细菌总数测定时，根据蛋糕卫生标准GB7099-2003要求或对标本污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿作为平行样。稀释液移入平皿后，应及时（冬季15-20分钟，夏季30-35分钟）将凉至46?C营养琼脂培养基（可放置于46±1?C水浴锅保温）注入平皿约15ml，并转动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入灭菌的空白平皿作空白对照。琼脂凝固后，不要长久放置，即应将平皿翻转，置36±1?C温箱内培养48±2h。为了控制污染，在取样进行检验的同时，于工作台上打开一块琼脂平板，其暴露的时间，应从该检样制备、稀释至加入平皿时所暴露的最长的时间相当，然后与加有检样的平皿同时置于温箱内培养以了解检样在检验操作过程中有无受到污染。由于均置后的蛋糕花酷似菌落，为了确定是否菌落，在取样检验的同时，可以根据所选的稀释度多做一个平皿不于培养，置于0-4℃左右的环境中，待结果观察时做以对照。

5、结果报告

菌落总数报告时，应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度乘以稀释倍数报告，若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。若有两个稀释度，其生长菌落数均在30-300

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之间，则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于2，应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字（见表1例2及3）。菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数表示（见表1“报告方式”栏）。注意到达规定培养时间，应立即计数。如不能立即计数，应将平板在0-4℃下存在，但不要超过24h。若平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应采用无片状菌落生长的平皿为该稀释度的的菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可计算半个平皿后乘2，以代表全皿菌落数。本次检验结果10-1稀释度为多不可计，10-2稀释度为287，10-3稀释度为55，两稀释液之比为1.9，菌落总数为两稀释度之和除以2，计算得41850，报告方式为42000或4.2×104。

表1 稀释度选择及菌落数报告方式

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应该注意的几个问题：

（1）操作要快而准，包括取样、加样、注入培养基等。

（2）样品抽取时要无菌操作，并及时送检。

（3）所用试剂应灭菌彻底并在尽快使用。

（4）样品稀释时一定要混合均匀。

（5）注入培养基前后，严格无菌操作。

（6）注意培养基温度合适，培养基薄厚均匀。

（7）每次检测中一定要有空白对照。

（8）微生物检验时以不超过两人为度。

（9）检测完要迅速进行培养。

（10）检测完毕，微生物还要紫外线杀菌。

总之，为了保证检验结果的准确无误，蛋糕菌落总数检测中，要注意些”细节性”的问题。否则，检验结果会有出处，尤其是位于标准界限的结果，往往会由于我们的操作手法而造成企业生死的判决书。

作者简介：

性别:女 出生年月:19800215 单位:铜川市产品质量监督检验所 职称:助理工程师 专业:农学 学历:大学本科 联系方式:131xxxxxxxx 详细邮寄地址:铜川新区鸿基南路2号

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