《环境工程微生物学》

实验报告

实验名称：­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ 总大肠菌群的检验           

专    业： 环境科学                   

班    级： 环科111                   

学    号： 1108100069                 

学生姓名： 余永浩                     

           

指导教师：_钱晓莉___                       

实验日期:__2013.4.15-2013.4.19_____                   

一、实验名称

总大肠菌群的检验

二、实验目的

（1）了解总大肠菌群的数量指标在环境领域的重要性，学会总大肠菌群的检验方法。

（2）通过检验过程，了解大肠菌群的生化特性。

三、实验原理

人的肠道中主要有3大类细菌：①大肠菌群（G^-菌）;②肠球菌（G⁺菌）;③产气荚膜杆菌（G⁺菌）。由于大肠菌群的数量最大，在体外存活时间和肠道致病菌相近，且检验方法比较简单，所以被定为检验肠道致病菌的指示菌。

总大肠菌群包括肠杆菌科中的埃希氏菌属（模式种：大肠埃希氏菌）、柠檬酸细菌属、克雷氏菌属及肠杆菌属。这4种菌属都是兼性厌氧、无芽孢的革兰氏阴性杆菌（G^-菌），他们的生化反应特点已在微生物的生理章节中介绍。

大肠菌群的检测方法主要有多管发酵和滤膜法。前者被称为水的标准分析法，即将一定量的样品接种到乳糖发酵管，根据发酵反应的结果，确证大肠菌群的阳性管数后在检索表中查处大肠菌群的近似值。后者是一种快速的替代方法，能测定大体积的水样，但至局限于饮用水或较为干净的水，目前在一些大城市的水厂采用此法。

四、实验仪器及其材料

（一）器皿

显微镜、锥形瓶（500ml）1个、试管（18mm×180mm）6或7支、、大试管（容积150ml）2支、移液管1ml2支及10ml一支、培养皿10套、、接种环、试管架一个

（二）试剂、材料

（1）化学药品：蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、琼脂、无水亚硫酸钠、牛肉膏、氯化钠、质量浓度16g/L的溴甲酚紫乙醇容溶液、质量浓度50g/L的碱性品红溶液、质量浓度20g/L的伊红水溶液、质量浓度5g/L的亚甲蓝水溶液

（2）采集于贵大新校区的生活污水

（3）革兰氏染色液一套：草酸铵结晶紫、革兰氏碘液、体积分数为95%的乙醇、番红染液。

（4）其他：100g/L的氢氧化钠、体积分数10%的HCl、pH试纸

五、    实验步骤：

（一）配制培养基：（4月15日）

1.乳糖蛋白胨培养基（供多管发酵的复发酵使用）

配方：蛋白胨10克、牛肉膏3克、乳糖 5克、氯化钠5克、溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL、蒸馏水1000 mL

制备：将蛋白陈、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2—7.4，再加人1 ml 16g/l的澳甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，每管10mL，68.95kPa (115℃，10lb）高压灭菌20min，取出后置于阴冷出备用。

2.三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基（供多管发酵的初复发酵使用）

按照乳糖蛋白胨培养基的配方和制法，除蒸馏水外，其他成分量浓缩三倍。

3. 品红亚硫酸钠培养基（即远藤氏培养基）

该培养基供多管发酵的平板画线使用。

（1）配方：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氢二钾3.5g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、无水硫酸钠5g、50g/L的品红乙醇溶液20mL。

（2）制备：先将琼脂加入900mL蒸馏水中加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀使之溶解，补足失水到1000mL，调整pH为7.2-7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于锥形瓶中，包装后灭菌。

4. 伊红-亚甲蓝培养基

（1）配方：蛋白胨10g、乳糖 10g、磷酸氢二钾2g、琼脂              20g—30g、蒸馏水l000ml、伊红水溶液（20g/L) 20mL、亚甲蓝水溶液（5g/L）13mL。

（2）制备：与品红亚硫酸钠的制备过程相同，琼脂加入900mL蒸馏水中加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀，补足失水到1000mL调整pH为7.2-7.4趁热用脱脂棉过滤，再加入乳糖，混匀后装于锥形瓶中，灭菌。

（二）测定步骤：（4月17日）

多管发酵法

（1）按要求配制乳糖蛋白胨培养基、三陪浓缩乳糖蛋白胨培养基、品红亚硫酸钠培养基、伊红-亚甲蓝培养基。 

（2）初发酵试验：在2支各装有50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大发酵管中，以无菌操作各加入水样100mL。在10支各装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的发酵管中，以无菌操作各加入10mL水样，混匀后置于37℃恒温箱中培养24h，观察其产酸产气的情况。

（3）确定性试验：用平板划线分离，将经培养24h后产酸的发酵管取出，无菌操作，用接种环挑取一环发酵液于品红亚硫酸钠培养基平板上划线分离，置于37℃恒温箱内培养18~24h，观察菌落特征。

（4）复发酵实验：

无菌操作，用接种环挑取具有培养基平板上菌落的特征的菌落于装有10mL普通浓度的发酵培养基内，每管可接种同一平板上的1~3个典型菌落的细菌，于37℃恒温箱内培养24h。观察。

六、    实验结果及其分析讨论：

（1） 在品红亚硫酸钠培养基平板上的菌落特征：

a:紫红色，具有金属光泽的菌落；

b：深红色，不带或者略带金属光泽的菌落；

c：淡红色，中心色较深的菌落。

（2） 在伊红—亚甲蓝培养基平板上的菌落特征：

a：深紫黑色，具有金属光泽的菌落;

b：紫黑色，不带或者略带金属光泽的菌落；

c：淡紫黑色，中心色较深的菌落。

（3）复发酵实验：

根据本次实验得到的结果的可以发现的，新校区的污水的细菌总数远大于国家标准（书上附录六表-1）。

 

第二篇：大肠菌群和粪大肠菌的检验

实验四 大肠菌群和粪大肠菌的检验

一、实验目的要求

1、 了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义。

2、 学习并掌握大肠菌群检验的原理和方法。

二、原理

大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。一般认为该菌群细菌可包括：大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。

食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the most probable number-简称MPN）表示。

三、试剂和仪器

（一）最先准备的器材

规格名称 数量 用途

1、500ml广口瓶 1个 稀释样品

2、500ml三角瓶 2个 制生理盐水

3、250ml三角瓶 1个 制EMB琼脂

4、18×180mm试管 8支 稀释及制双料乳糖胆盐发酵管

5、18×150mm试管 20～25支 单料乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管 6、13×130mm试管 20支 制蛋白胨水、EC肉汤

7、1ml移液管 5 支

8、10ml移液管 3 支

9、直径为90mm平皿 12套 制EMB平板

10、250ml量筒 1支

（二）应灭菌消毒的器材

剪刀1把 开瓶器 不锈钢药匙1把 滴管胶头4只 称量纸适量

（三）应制备的培养基

培养基总量 所用容器

1、 0.85%NaCl生理盐水 300ml 500ml三角瓶

2、 乳糖胆盐发酵管

双料： 10ml/支 5支 60ml 18×180mm试管(装有导管)

单料： 10ml/ 8支 90ml 18×150mm试管(装有导管)

3、 EMB琼脂： 1瓶 120ml 250ml三角瓶

4、 乳糖发酵管： 3ml/支 5支 20ml 13×130mm试管(装有导管)

5、 EC肉汤： 3ml/支 6支 20ml 13×130mm试管(装有导管)

6、 蛋白胨水： 2ml/支 10支 20ml 13×130mm试管

四、实验内容

（第一天） 样品处理及初发酵接种：

所需培养基与器材：

? 培养基：

1. 0.85%NaCl生理盐水： 300ml 1瓶

2. 乳糖胆盐发酵管

双料： 10ml/支 3～5支 18×180mm试管(有导管)

单料： 10ml/支 6～8支 18×150mm试管(有导管)

? 灭菌器材：

500ml广口瓶（内带5mm带玻璃珠） 1～2个

18×180mm试管 3支

250ml量筒 1支

1ml移液管 5 支

10ml移液管 3支

当样品袋装样品时：消毒酒精、棉花、无菌剪刀、称量纸、不锈钢药匙、橡皮胶头3只； 当样品瓶装样品时：石炭酸消毒纱布两块、开瓶器。

（一）、 样品处理（无菌操作）

? 样品：瓶装饮料或酿造酒类：

用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，用石炭酸纱布盖好，再用灭菌的开瓶器将盖打开，将含二氧化碳的样品倒入一信灭菌瓶内，加盖假盖，口勿盖紧，在其上覆盖在一块灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出后，妈样进行稀释。

? 乳制品：

袋装奶粉用75%的酒精棉球涂擦消毒袋口，以无菌操作取样，放入灭菌的三角瓶内，将225mL温热的灭菌生理盐水徐徐加入（先用少量生理盐水将奶粉调成糊状，再全部加入，以免结块）。

（二）、 检样稀释与乳糖胆盐发酵试验----[初发酵]（无菌操作）

1、 用无菌量筒量取225mL灭菌生理盐水倒入灭菌玻璃瓶内，用10ml移液管吸取9mL生理盐水注入无菌试管中，共2支，备用。

2、 以无菌操作将检样25mL(g)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8 000～10000r/min的速度处理1min，做成1：10的均匀稀释液。

3、 用10ml移液管吸取1：10的稀释液10ml分别注入双料乳糖胆盐发酵管中：共3支。

4、 用1ml移液管吸取1∶10的稀释液1ml分别注入单料乳糖胆盐发酵管中：共3支。

5、 用同上一支1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，换一支吸管，吸吹5次，或振摇试管混匀，做成1∶100的稀释液。再用这支吸管吸取1∶100稀释液1mL分别注入单料乳糖胆盐发酵管中：共3支。

? 注意：做10倍递增稀释时，每递增稀释一次，要换用1支1mL灭菌吸管。 ? 放入培养箱培养：

将接种后的乳糖胆盐发酵管置36±1℃温箱内，培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产酸产气者（培养液由紫蓝色变成黄色并有气泡），则按下列程序进行试验。

（第二天）进行EMB平板分离，[EC肉汤、蛋白胨水接种（粪大肠菌群检验）]：（无菌操作） 所需培养基与器材：

? 培养基：

1. EMB琼脂平板 5只

2. EC肉汤： 5支

3. 蛋白胨水： 5支

? 器材：

44.5±0.2℃水浴箱，接种环。

（一）、 接种EMB平板进行分离培养

将产气的发酵管分别转种在EMB琼脂平板上（一管对一个平板 ），置36±1℃温箱内，培养18～24h，然后取出，观察菌落形态，并挑取可疑菌落做：革兰氏染色和证实试验。

在EMB平板上的典型菌落：呈紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常有金属光泽。由于药物影响，亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、湿润等，常为大肠杆菌，均应注意挑选。

（二）、 接种EC肉汤（用于粪大肠菌群检验）

用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物转种于EC肉汤管内（一管对一个管 ），置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面)，培养24±2h。经培养后，如所有EC肉汤管均不产气，则可报告：为阴性；如有产气者，则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养18～24h，凡平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性。

（三）、 接种蛋白胨水：（用于粪大肠菌群检验）

用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物转种于蛋白胨水内（一管对一个管 ），置44.5±0.2℃水浴箱内，培养24±2h。同时取一蛋白胨水培养基不接种，一起培养做对照试验。 （第三天）进行乳糖发酵（证实试验）接种、镜检、靛基质试验、观察EC肉汤发酵结果 所需培养基与器材：

? 培养基：

1. 乳糖发酵管：5支

2. 靛基质试剂、（欧—波试剂）

3. 革兰氏染色液

? 器材：显微镜

（一）、 乳糖发酵接种

在EMB平板上的典型菌落：呈紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常有金属光泽。由于药物影响，亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、湿润等，常为大肠杆菌，均应注意挑选

从EMB平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个同时接种乳糖发酵管，置36±1℃温箱内培养24±2h，观察产气情况。

（二）、 进行镜检

从EMB平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色。大肠菌群菌：革兰氏染色阴性无芽胞短杆菌。

（三）、 进行靛基质试验

向培养后的蛋白胨水中沿管壁加入靛基质试剂（欧—波试剂）0.5mL，静置片刻，观察液面。阳性反应者，液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。则证实为粪大肠菌群阳性。

（四）、 观察EC肉汤发酵结果

如所有EC肉汤管均不产气，则可报告：为阴性；如有产气者，则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养18～24h，凡平板上有典型菌落者，则证实：为粪大肠菌群阳性。

（第四天）观察乳糖发酵结果及器材的消毒和清洗

（一）、 观察乳糖发酵结果

观察：乳糖发酵管内是否有气体产生

? 凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。

（二）、 查表报告结果

根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。

根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。

五、思考题

1、 大肠菌群检验中为什么首先要用乳糖胆盐发酵管？

2、 为什么大肠菌群的检验要经过复发酵才能证实？

3、 复发酵时为什么使用乳糖发酵管但不需要加胆盐？

4、 所有发酵管均为阴性反应时，检验结果可否报告为“零”？