大肠菌群检验标准操作程序

1 大肠菌群

1.1 试剂：月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)、磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水、无菌1mol/L NaOH、无菌1mol/LHCL

1.2 仪器：冰箱、恒温培养箱、恒温水浴锅、显微镜、均质器或灭菌乳钵、架盘药物

天平、灭菌吸管1ml、10ml、灭菌锥形瓶、灭菌玻璃珠、灭菌培养皿、灭菌试管、灭菌刀、剪子、镊子

1.3 大肠菌群MPN计数的检验程序

36±1℃  48±2h

 

                                36±1℃       48h±2h       

2 操作：

2.1 样品的稀释

2.1.1 固体和半固体样品：以称取25g样品，放入盛有225ml生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内， 8000r/min-10000r/min的均质1-2min，或放入盛有225ml生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1-2分钟，做成1：10的均匀稀释液。

2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225ml生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。

2.1.3 样品匀液的PH值应不6.5-7.5之间，必要时分别用1mol/L NaOH或1mol/LHCL调节。

2.1.4 用1ml灭菌吸管或微量移液管理吸取1：10样品匀液1ml，沿管壁缓缓注入注入9ml生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用一支1ml无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。

2.1.5 根据对样品污染情况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀淮。每递增稀释1次，换用一支1ml无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15分钟。

2.2 初发酵试验

2.2.1 每个样品，选择三个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml（如接种量超过1ml，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气都为大肠杆菌阴性。

2.3 复发酵试验

2.3.1 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤

（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳

性管。

2.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告

2.4.1 按确证的大肠菌群LST阳性管数，检萦MPN表，报告每g(ml)样品中大肠菌群的MPN值。（见下表）              

大肠菌群最可能数（MPN）检索表

 

第二篇：食品卫生微生物学检验菌落总数检查操作程序

菌落总数检查操作程序

1 实验前准备

1.1 稀释水、刻度吸管、平皿

稀释水：瓶装PH值7.0无菌生理盐水，塞上胶塞，按高压蒸气灭菌操作程序，121℃湿热灭菌30分钟。取0.2ml、1ml、5ml、10ml刻度吸管、平皿置于金属容器中，140℃干热灭菌2小时。

1.1.1 培养基准备：

平板计数琼脂培养基

以上实验所需干粉培养基均由中检所提供，分别按说明加适量水加热溶解后，塞上胶塞，湿热灭菌30分钟备用。

1.1.2 无菌衣

将无菌衣、头罩、口罩、乳胶手套叠好，置于无菌衣袋中，湿热灭菌30分钟。

1.2 无菌室及操作台的准备

用0.1%的新洁尔灭溶液或75%乙醇溶液将操作台，天花板，墙壁，地面擦洗一遍，同时将操作台用0.1%新洁尔灭溶液或75%乙醇溶液擦洗一遍。将实验所需物品通过传递窗移入无菌室，打开空气净化系统，打开紫外灯，杀菌0.5-1个小时。

2 实验操作

2.1 进入无菌室更衣间，用0.1%新洁尔灭溶液或75%乙醇溶液消毒手及腕部至少一分钟，戴上头罩、口罩，穿好无菌衣及无菌手套后，进入无菌室，开始实验操作。

菌落总数操作程序

选择2-3个适宜稀释度的样品匀液，各取1ml分别放入无菌皿内

 

2.2 供试液的稀释及操作

2.2. 1 固体：取供试品25g，加无菌生理盐水225ml，溶解混匀，作为1：10的供试液。

2.2.2 液体：取供试品25 ml，加无菌生理盐水225ml，溶解混匀，作为1：10的供试液。

2.2.3 用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1 ml，沿管壁缓慢注于盛有9 ml稀释液的无菌试管中，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。

2.2.4 按以上操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1 ml无菌吸管或吸头。

2.2.5 根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1 ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。

2.2.6 及时交15-20 ml冷却至46的平析计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

2.2.7 待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48±2小时。如果样品中可能含有在琼脂培养表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂覆盖一薄层琼脂培养基，凝固后翻转平板培养。

2.3 菌落计数

2.3.1 做平板菌落计数时，可用肉眼观察。必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。

2.4 菌落计数的报告

2.4.1 平板菌落数的选择

选取菌落数在30-300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数；其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片

状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2，代表一个平板菌落数。平板内出现菌落间无明显界线的链状生长时，则应将每条单链作为一个菌落计数。

2.4.2 菌落总数的计算方法

2.4.2.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释度，作为每g(ml)样品中菌落总数结果。

2.4.2.2 若有两个连续稀释度的平均菌落数在适宜计数范围内时，按以下公式计算：

ΣC

N  =          

        （n₁＋0.1n₂）d

式中：

N——样品中菌落数；

ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n₁——第一稀释度（低稀释度）平板个数；

n₂——第二稀释度（高稀释度）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）

2.4.2.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

2.4.2.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

2.4.2.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

2.4.2.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30-300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

2.4.3 菌落数的报告

菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告；菌落数大于或等于100时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位

数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字；若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延；若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/ml为单位报告。