口蹄疫正向间接血凝试验操作要点
免疫抗体检测是科学掌握动物免疫接种疫苗后抗体产生和消长变化的有效方法之一。口蹄疫正向间接血凝试验就是用口蹄疫抗原检测未知血清中是否含有口蹄疫抗体的血清学检测方法之一。近年来，此方法经常用于牲畜接种口蹄疫疫苗后能否产生抗体或抗体滴度能否达到免疫保护，以利于指导畜牧业生产。
一、原理
用已知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验，亦称间接血凝。 抗原与其对应的抗体相遇，在一定条件下形成抗原—抗体复合物。但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。将抗原吸附（致敏）在红血球表面，再与抗体结合，红血球便出现凝集现象，不仅肉眼能看见，而且反应的敏感性大大提高。口蹄疫正向间接血凝试验就是将口蹄疫纯化病毒致敏到绵羊红血球表面，制成口蹄疫血凝抗原，用于检测动物血清中的口蹄疫抗体水平。
二、适用范围
主要用于检测口蹄疫疫苗接种动物后血清抗体效价。
三、器材
1、 96孔110～120度V型医用血凝板，与血凝板大小相同的玻板。
2、 微量移液器与吸头。
3、 口蹄疫血凝抗原（口蹄疫正向血凝诊断液）。
4、 口蹄疫对照阴性血清。
5、 口蹄疫对照阳性血清。
6、 稀释液。
7、 待检血清（被检血清）。
四、试验方法
1、加稀释液
在血凝板上1～6排的1～9孔；第7排的1～4孔；第8排的1～12孔各加稀释液50微升。
2、稀释待检血清
取1号待检血清50微升加入第1排第1孔，混匀（避免产生过多的气泡），取出50微升移入第2孔，混匀后取出50微升移入第3孔??直到第9孔混匀后取出50微升丢弃。此时第1排1～9孔待检血清的稀释度（稀释倍数）依次为：1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256，1:512。
取2号待检血清加入第2排；取3号待检血清加入第3排??均按上法稀释，注意！每取一份血清时，必须更换吸头一个。
3、稀释阴性对照血清
在血凝板上的第7排第1孔加阴性血清50微升，倍比稀释至第4孔，混匀后从该孔取出50微升丢弃。此时阴性血清对照孔依次为：1:2，1:4，1:8，1:16。
4、稀释阳性对照血清
在血凝板上的第8排第1孔加入阳性血清50微升，倍比稀释至第12孔，混匀后从该孔取出50微升丢弃，此时阳性血清稀释倍数为1:2～1:4096。
5、加血凝抗原
被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照血清各孔、稀释液对照孔均各加血凝抗原25微升。
6、振荡混匀
将血凝板置于微量振荡器上振荡1分钟，然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀，不出现血球沉淀为合格。盖上玻板，静置于室温下1.5～2小时判定结果，也可延至翌日判定。
7、 判定标准
移去玻板，将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清1:16孔，稀释液对照孔，应无凝集，或仅出现“+”凝集。
阳性血清对照1:2～1:256各孔应出现“++~++++”凝集为合格。
在对照孔合格的前提下，再观察待检血清各孔，以呈现“++”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。例如1号待检血清1～5孔呈现“++~++++”凝集，6~7孔呈现“++”凝集，第8孔呈现“+”凝集，第9孔无凝集，那么就可判定该份血清的口蹄疫抗体效价为1:128。
接种O型口蹄疫灭活苗的猪群血清O型抗体效价达到1:128（或1:128以上）为免疫合格。
五、注意事项
1、试验前，必须仔细阅读试剂盒内的说明书。
2、严重溶血或严重污染的血清样品不宜检测，以免发生非特异性反应。
3、为确保试验判断准确，不得使用90度和130度血凝板。
4、血凝板用后应及时在水龙头下冲净血球，再用蒸馏水或去离子水冲洗3次，甩干水分放 37℃ 恒温箱内干燥备用。检测用具应煮沸消毒，再置于 37℃ 恒温箱内干燥备用。
5、每次检测做一份阴性、阳性和稀释液对照即可。
输血能够迅速的补充血容量，纠正休克，增强机体供氧能力，增强抗病力，对抢救动物的生命有重要意义。然而，输血不当时，往往会引起不良反应，甚至危及动物生命。因此只有切实掌握了输血的规律，正确实施才能够达到预期的效果。
随着社会的发展，宠物已经成为家庭中不可或缺的部分，为了更好的拯救他们于危难之中，作为从业人员必须掌握配血与输血。
输血的适应症
1、输血疗法可适用于各种原因引起的贫血；
2、车祸、手术、外伤等引发的大失血；
3、剧烈呕吐、腹泻引起的血容量降低；
4、各种原因引起的休克；
5、血小板和凝血因子缺乏引起的凝血不良；
6、白细胞减少症和低蛋白血症等病症。
7、烧伤时，输血可有效预防休克；
输血的作用
1、输血可以起到迅速补充循环血量、维持一定的血压、增加血液的凝固性和血红蛋白的浓度、增加血液运输氧的能力以及刺激机体的造血机能、防止休克等作用。
2、另外对供血者采取相应的免疫后，其血制品对犬细小病毒、犬瘟热可产生特异性的抗病力。
配血试验
在临床上，输血前为了保证安全，应做配血试验，根据要求和实验室条件以分为交差配血和简易配血法。在配血之前我们还应掌握以下内容：
【犬的血型】 通过直接或间接凝集反应以及溶血反应，人们逐渐认识了犬的各种红细胞抗原（DEA）。到目前为止，已报道的犬血型有：红细胞抗原1.1（A1）；红细胞抗原1.2（A2）；红细胞抗原3（B）；红细胞抗原4（C）；红细胞抗原5（D）；红细胞抗原6（F）；红细胞抗原7（Tr）和红细胞抗原8（He），最近澳大利亚又发现犬有红细胞抗原1.3（A3）血型。
其中最强的抗原性因子： 红细胞抗原1.1；红细胞抗原1.2；红细胞抗原7。犬的红细胞表面不只有一个红细胞抗原，如红细胞可以是DEA1.1阳性或DEA1.1阴性，同时DEA1.1阴性的红细胞也可以是DEA1.2阳性或DEA1.2阴性，这些血型表现为等显性遗传。血型为DEA1.1、DEA1.2和DEA7阳性的犬血只能给相同血型的犬输；研究发现Greyhound（灵缇犬）出现DEA1.1和 DEA1.2阳性的机率很小 。
【供血者的选择要求】
1、供血犬的体重应大于25公斤；
2、年龄在2-8岁之间；
3、临床检查正常（包括血常规及血液生化）；
4、定期注射疫苗；
5、供血者不应有红细胞抗原1.1、红细胞抗原1.2或红细胞抗原7。由于Greyhound（灵缇）血液的红细胞压积很高，静脉容易采血并且血液中很少含有DEA1.1、 DEA1.2和DEA7，可将Greyhound作为理想的供血者
6、根据地域的不同，相应淘汰存在原虫病供血者。
7、特别应注意供血者不可有受血经历。
8、不处于妊娠期的犬（包括有怀孕史的犬，犬怀孕时可以自动产生抗 DEA1.1的同种抗体，用其血或给其输血都易引起输血反应）。
9、采血量不应超过10毫升/公斤体重；
【血液的采集及保存】
可以从犬的颈静脉或从麻醉犬的股内动脉采集血液。采血常用的保存液：
1、枸橼酸磷酸葡萄糖（CPD）；
2、枸橼酸磷酸葡萄糖腺嘌呤（CPD-A1）
3、酸性枸橼酸葡萄糖（ACD）；
4、肝素。
【血液的保存】
1、犬的全血制品应保存在3-6℃的条件下，
2、另外应使抗凝剂和采血袋在采血前保持在5℃左右，以防止溶血。
3、采血过程中必须轻轻晃动采血袋。
【交叉配血试验】
1、交叉配血试验可以分为主侧配血和次侧配血两部分，
2、主侧配血是受血犬的血浆或血清和供血者的红细胞反应与否；
3、次侧配血是受血犬的红细胞与供血者的血浆或血清反应与否。
4、任何程度的凝集反应或溶血反应都表明血型不相容。
5、具体实验步骤为：
a. 分别取供血者和受血犬的新鲜血液，用EDTA抗凝。
b. 用0.9%氯化钠溶液洗三遍红细胞，分别以1000转/分钟离心15秒，去掉上清液。 c. 将红细胞泥配成4%红细胞盐水悬液。
d. 主侧配血：向10×75毫米的试管加入两滴供血者的4%红细胞盐水悬液和两滴受血犬的血清或血浆。
e. 次侧配血：向10×75毫米的试管加入两滴受血犬的4%红细胞盐水悬液和两滴供血者的血清或血浆。
f. 以1000转/分钟离心1分钟。
g. 取出观察上清液有无溶血，轻轻晃动试管，观察有无凝血。
【简易的“三滴法”配血实验】
方法为取供血者血液1滴、受血犬血液1滴及抗凝剂1滴于载玻片上，混合后肉眼观察有无凝集，若无凝集，则可输血。
【输血方法】
1、静脉输血是最常用的一种方法。
2、如果静脉输血确实有困难，也可进行腹腔输血，但腹腔输血的作用比较慢。
3、幼犬静脉输血失败，可以进行骨髓内输血，用消毒后的20号针头或骨髓穿刺针刺入股骨或肱骨近端。
4、将血袋取出后反复颠倒数次，使沉积的红细胞充分混匀。
【输血并发症】
如果供血者和受血犬的血型相同，一般很少发生并发症。犬输血的并发症主要有：发热、过敏、溶血、循环负荷过重、低钙血症以及血凝病等。
发热和过敏主要表现为高热、红斑和瘙痒等症状，临床处理措施为减慢输血速度，给予退热剂，应用抗组织胺药物，如盐酸苯海拉明，剂量为2mg/kg；
溶血主要表现为血红蛋白血症、血红蛋白尿症、乏力、呕吐、发热、心动过速、急性肾衰
和凝血等症状，如果发生溶血反应，应立即停止输血，给予静脉输液以及皮质类固醇和抗组织胺药物；
循环负荷过重是由于输血量过大造成的，可以引起肺水肿，应用速尿处理，用量为2-4mg/kg；
低钙血症：输入大量含枸橼酸盐抗凝剂的血液可使犬产生低钙血症，犬临床表现为肌肉震颤、心率不齐或者呕吐。发生上述症状可以停止输血，一般可用葡萄糖酸钙治疗；
血凝病：大量输入全血或浓缩红细胞可以造成犬发生血凝病，可用富含血小板的血浆进行治疗。