实验一：米氏常数的测定

双倒数法测定过氧化物酶的米氏常数

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【实验目的】以过氧化物酶为例，掌握测定酶促反应初速率和米氏常数的原理及方法

【实验原理】1913年，Michaelis和Menten运用酶反应过程中形成中间络合物的原理，首先提出了底物浓度和酶促反应速率的关系式，即著名的米氏方程：

式中：v为反应初速率（微摩尔浓度变化/min）；V_max为最大反应速率（微摩尔浓度变化/min）；[S]为底物浓度（mol/L）；K_m为米氏常数（mol/L）。这个方程式表明当已知K_m及V_max时，酶反应速率与底物浓度之间的定量关系。K_m值等于酶促反应速率达到最大反应速率一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同酶的K_m值不同，同一种酶与不同底物反应K_m值也不同，K_m值可以近似的反应酶与底物的亲和力大小：K_m越大表明亲和力越小；K_m越小表明亲和力越大。大多数纯酶的K_m值在0.01~100 mmol/L。通过米氏方程的不同变形，可有多种求算米氏常数的方法，一般较常用的双倒数法，即取米氏方程的倒数式：以对作图得一直线，该直线与横轴截距。

过氧化物酶是一种对氢受体（H₂O₂）底物有特异性，对氢供体底物缺乏特异性的酶，它可催化过氧化氢氧化许多多元酚或多元胺类底物发生显色、荧光或化学发光反应，可用于微量过氧化氢含量测定，也可以和其它酶反应系统偶联可用于测定许多与生命相关的物质：如葡萄糖、半乳糖、氨基酸、尿酸及胆甾醇等，亦是免疫分子和核酸分析中常用的标记物。通常使用的过氧化物酶是从植物辣根中提取的，因此也称为辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）。HRP属于含血红素蛋白的一种，是由辅基——氯化血红素（铁卟啉）和脱辅基蛋白（糖蛋白）组成，分子量为44000。

HRP是双底物酶（过氧化氢+多元酚或胺类底物），为求其对某一底物的K_m，通常的做法是令另一底物的浓度相对于待测底物大大过量，即可把该酶促反应当作单底物反应来处理。本实验我们选用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）作为氢受体，它可被Hb催化过氧化氢氧化生成有色产物，该产物在反应条件下（pH5-7左右）为蓝色物质（l_max=650 nm）。实验中我们使TMB的浓度大过量，测定HRP对H₂O₂的K_m值（反之亦可测定HRP对TMB的K_m值）。

【实验仪器及试剂】

仪器：日立 UV-3010紫外可见分光光度计；石英比色皿（1 cm）：2只；100 mL微量取样器1支（枪头若干）；1 mL取液器一支；电磁搅拌器1台（1 cm聚四氟乙烯搅拌子1个）

试剂：过氧化物酶（HRP溶液： mol/L；3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液（TMB）： mol/L（DMSO溶液）；H₂O₂溶液： mol/L；磷酸缓冲液（PBS）：pH= ； mol/L

【实验步骤】

在1 cm的比色皿（内置搅拌子）中加入1.7 mL PBS，然后在搅拌下，依次加入100 mL HRP、TMB和不同量的H₂O₂溶液，马上移入样品架，记录650 nm处吸收峰强度随时间变化的曲线。（参比：1.7 mL PBS+100 mL HRP+100 mL TMB）

【数据记录与处理】

温度：______